大腦類器官模型在精神疾病研究中的現(xiàn)狀及展望☆

黃兢 劉方琨 唐慧 伍海姍李樂華 陳晉東

精神疾病是常見的病因復(fù)雜、發(fā)病率高、多基因遺傳疾病，造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前各種體內(nèi)外模型已廣泛用于研究精神疾病的病因?qū)W機(jī)制和精神藥物相關(guān)研究。然而，由于精神疾病的復(fù)雜性，如何選用合適的模型從結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和蛋白水平更好地研究精神障礙的發(fā)病機(jī)制和藥物作用，具有重要的臨床意義[1]。大腦類器官（cerebral organoids）是由干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化形成的大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)，可一定程度上在體外模擬人類胚胎早期大腦的發(fā)育過程和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在研究精神疾病的起源和病理學(xué)、藥物篩選和基因改造方面顯示了很大潛力[2]。本綜述對(duì)大腦類器官在精神醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展與局限性進(jìn)行探討，并對(duì)大腦類器官未來的發(fā)展和應(yīng)用進(jìn)行評(píng)估與展望。

1 大腦類器官模型的建立與研究進(jìn)展

自1981年研究人員從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出胚胎干細(xì)胞[3]，干細(xì)胞技術(shù)在近幾十年來快速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了人類大腦類器官的體外培養(yǎng)。1998年THOMSON等[4]成功分離出人胚胎干細(xì)胞，并將其進(jìn)一步分化得到各種類型的組織細(xì)胞，包括神經(jīng)上皮和胚胎神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等。2007年，TAKAHASHI等[5]在已分化成熟的體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Oct3/4（Pou5f1）、Sox2、Klf4和c-myc等 4個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行重編程，使其回到多能性狀態(tài)，得到人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）。 與胚胎干細(xì)胞相比，hiPSCs取材方便，來源廣泛，可以取材于患者的體細(xì)胞，避免了倫理問題和免疫排斥反應(yīng)，為個(gè)體精準(zhǔn)治療提供了新的途徑。最早用于大腦研究的體外模型是擬胚體（embryoid bodie，EB）來源的神經(jīng)玫瑰花結(jié)（neural rosettes，NR）。神經(jīng)玫瑰花結(jié)是hiPSCs分化為大腦類器官過程中出現(xiàn)的一種類似人體神經(jīng)管結(jié)構(gòu)，是各種神經(jīng)細(xì)胞分化的基礎(chǔ)。hiPSCs技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展促進(jìn)了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞神經(jīng)球體和三維神經(jīng)上皮組織的產(chǎn)生，它們能夠在一定程度上反映人類大腦的基因?qū)W特點(diǎn)，但是它們沒有形成完整、復(fù)雜的大腦結(jié)構(gòu)，也缺少大腦不同亞區(qū)之間的協(xié)調(diào)作用[6]。

2013年，LANCASTER等[7]首次利用 hiPSCs定向誘導(dǎo)分化形成大腦類器官，并用于小頭畸形研究。他們將hiPSCs定向誘導(dǎo)分化，產(chǎn)生具有內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的擬胚體結(jié)構(gòu)，隨后經(jīng)過神經(jīng)外胚層、神經(jīng)上皮層，最后形成類似早期胚胎期大腦皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)，能一定程度上反映人體早期胚胎期大腦的發(fā)育過程[8]。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，小頭畸形大腦類器官的大小、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目和分布與正常大腦類器官相比，有顯著區(qū)別[7]。DANG等[9]對(duì)類器官進(jìn)行RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至第30天的大腦類器官與孕8～9周的人類胎兒大腦標(biāo)本基因表達(dá)譜十分相似。與動(dòng)物模型和細(xì)胞培養(yǎng)等研究手段相比，大腦類器官可以在一定程度上體外模擬人類胚胎早期大腦的發(fā)育過程和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并能較好地保持人體特異性基因型和蛋白表達(dá)水平，有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值[2]?；蚓庉嫻ぞ哌M(jìn)步，如規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）、轉(zhuǎn)錄激活樣因子核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effectors nucleases，TALENs）、 鋅指核酸酶 （zincfinger nucleases，ZFN）等可以實(shí)現(xiàn)對(duì)任意基因序列的精準(zhǔn)編輯。這些基因編輯技術(shù)在大腦類器官模型中應(yīng)用，為疾病基因突變分析、目標(biāo)基因修復(fù)以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因研究等提供了更有效的平臺(tái)。

大腦類器官作為大腦疾病體外模型已廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究中。研究人員可以直接將患者的體細(xì)胞重編程為hiPSCs，最終得到具有患者遺傳背景的大腦類器官。通過這種人體細(xì)胞來源的神經(jīng)組織模型，人們可以精確地分析不同神經(jīng)精神疾病受到影響的大腦區(qū)域和細(xì)胞類型，并進(jìn)行基因?qū)W分析和機(jī)制探討。大腦類器官隨后被應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，如大腦發(fā)育疾病、感染性疾病、癲癇、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等[10-14]。大腦類器官模型的進(jìn)一步優(yōu)化以及與其它生物調(diào)控技術(shù)等結(jié)合也促進(jìn)其進(jìn)一步發(fā)展和在臨床中應(yīng)用。

2 大腦類器官模型在精神疾病研究中的應(yīng)用

動(dòng)物模型是研究精神疾病病因?qū)W和藥理學(xué)的重要手段，它們?cè)谘芯烤窦膊〉膯位蛲蛔円约鞍l(fā)現(xiàn)藥物新靶點(diǎn)方面具有非常重要的意義。然而，由于精神疾病的復(fù)雜性，且動(dòng)物缺乏人類遺傳特性和某些人類特有的大腦區(qū)域，很難利用動(dòng)物模型從結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和蛋白水平研究精神障礙的發(fā)病機(jī)制和藥物作用[1]。非人類靈長類動(dòng)物模型和人類腦組織模型的資源匱乏和倫理問題，限制了精神疾病研究的發(fā)展。

大腦類器官作為一種新興的體外模型，在精神疾病研究中發(fā)揮了重要作用。精神分裂癥是高度遺傳的精神障礙，基于精神分裂癥患者的DNA全基因組測(cè)序的研究發(fā)現(xiàn)15q11.2基因拷貝數(shù)變異是其危險(xiǎn)因素之一[15-16]。YOON等[17]比較具有15q11.2拷貝數(shù)微缺失與未缺失的iPSCs來源人類神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，15q11.2拷貝數(shù)微缺失可以導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞粘著連接和頂端極性缺陷。進(jìn)一步研究和基因分析發(fā)現(xiàn)，CYFIP1和WAVE信號(hào)通路的上位相互作用可能通過影響神經(jīng)干細(xì)胞功能來增加神經(jīng)精神疾病的易感性[17]。研究人員同時(shí)也用大腦類器官研究與精神疾病相關(guān)的其他常見遺傳突變。精神分裂癥斷裂基因1（disrupted-in-schizophrenia 1，DISC1）是包括精神分裂癥、抑郁癥和雙相障礙等很多精神疾病的潛在易感基因，盡管對(duì)DISC1的研究眾多，DISC1蛋白如何與其他蛋白發(fā)生相互作用從而影響大腦功能卻鮮有報(bào)道[18]。研究人員將攜帶DISC1突變精神分裂癥患者的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為大腦類器官，發(fā)現(xiàn)了重要結(jié)果：DISC1和核分布蛋白類nudE因子 1 （nuclear distribution protein nudE-like 1，NDEL1）結(jié)合能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的分裂，DISC1突變導(dǎo)致精神分裂癥患者的神經(jīng)細(xì)胞分裂遲滯[19]。SRIKANTH等[20]在此基礎(chǔ)上利用TALEN技術(shù)得到DISC1突變的大腦類器官，發(fā)現(xiàn)這些類器官與正常對(duì)照組相比，有著明顯的形態(tài)結(jié)構(gòu)和增殖異常。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，加用WNT信號(hào)通路抑制劑可以逆轉(zhuǎn)DISC1突變導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)和增殖異常，揭示了DISC1突變、WNT信號(hào)通路和精神分裂癥的潛在聯(lián)系。

大腦類器官在孤獨(dú)癥研究中也取得了一定進(jìn)展。比較孤獨(dú)癥患者及其家屬iPSCs誘導(dǎo)分化而來的端腦類器官發(fā)現(xiàn)，孤獨(dú)癥患者的類器官并沒有出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元興奮性異常。全基因組測(cè)序分析提示：孤獨(dú)癥患者的類器官細(xì)胞周期增快，且 γ-氨基丁酸 （γ-aminobutyric acid，GABA）能抑制性神經(jīng)元增多。隨后的基因干預(yù)研究證實(shí)，F(xiàn)OXG1過表達(dá)是導(dǎo)致GABA能抑制性神經(jīng)元增多的原因，并與孤獨(dú)癥疾病進(jìn)展及癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)[21]。

同精神分裂癥與孤獨(dú)癥一樣，雙相障礙也是病因復(fù)雜的遺傳疾病，遺傳率高達(dá)80%[6，22]。大腦類器官模型也運(yùn)用到了雙相障礙的研究中，以探討大腦發(fā)育過程紊亂和疾病發(fā)生的關(guān)系。MADISON等[23]比較雙相障礙患者與其家屬大腦類器官分化早期的神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，患者神經(jīng)前體細(xì)胞的CXCR4表達(dá)明顯增高。對(duì)患者的神經(jīng)前體細(xì)胞使用抑制劑糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)前體細(xì)胞的發(fā)育異常可以被修復(fù)[23]。

大腦類器官模型在藥物對(duì)胚胎早期大腦發(fā)育及機(jī)制研究方面也顯示了很大潛力。WANG等[24]和ZHU等[25]利用大腦類器官模型發(fā)現(xiàn)酒精和尼古丁等可能導(dǎo)致神經(jīng)分化和腦區(qū)形成異常。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)單胺氧化酶抑制劑反苯環(huán)丙胺（tranylcypromine）能抑制大腦類器官體外神經(jīng)組織增殖，并降低神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目，以及組蛋白去甲基化相關(guān)基因的表達(dá)，如賴氨酸去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）和二甲基化組蛋白（dimethylated H3K4，H3-di-K4）等[26]。

除此之外，研究人員嘗試培養(yǎng)特定腦區(qū)的類器官以進(jìn)行精神疾病相關(guān)研究，如海馬類器官、中腦類器官、丘腦類器官等。XIANG等[27]成功培養(yǎng)與精神疾病密切關(guān)聯(lián)的丘腦類器官，甚至將丘腦類器官和額皮質(zhì)類器官融合培養(yǎng)以研究精神疾病的起因。

3 大腦類器官模型的不足與展望

HiPSCs細(xì)胞誘導(dǎo)形成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及大腦類器官的成功建立，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型帶來了新的方向。然而，大腦類器官在精神科研究領(lǐng)域應(yīng)用目前仍較少，而且存在一些問題和局限性，需要進(jìn)一步研究和改進(jìn)。

首先，將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為hiPSCs有較高的技術(shù)要求，在成纖維細(xì)胞重編程為干細(xì)胞的過程中，可能出現(xiàn)細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)變異，如拷貝數(shù)增加、染色體異常和點(diǎn)突變等，影響誘導(dǎo)后的干細(xì)胞基因穩(wěn)定性[28-29]。因此，重編程后的hiPSCs難以完全準(zhǔn)確反映患者的遺傳特點(diǎn)?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展，在一定程度上可以實(shí)現(xiàn)特定基因的點(diǎn)突變，得到穩(wěn)定、可誘導(dǎo)特定疾病模型的干細(xì)胞[28]。另外，如何長期穩(wěn)定地培養(yǎng)已分化成熟的大腦類器官仍是一大難題。目前，大腦類器官系統(tǒng)僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，其他器官的干細(xì)胞培養(yǎng)已逐漸轉(zhuǎn)向應(yīng)用于移植治療，如何將大腦類器官系統(tǒng)用于臨床，需要更深入的研究。

大腦類器官已經(jīng)應(yīng)用于多種神經(jīng)精神疾病的模型構(gòu)建，并且取得了一些突破性的進(jìn)展。來源于患者皮膚細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞等細(xì)胞經(jīng)重編程得到的多能干細(xì)胞，可以誘導(dǎo)分化為有特定基因變異的疾病模型，也可用于靶向藥物篩選等。然而，精神疾病是多個(gè)致病基因和外界環(huán)境交互作用導(dǎo)致的，完善的機(jī)制研究和模型構(gòu)建需要聯(lián)合大腦類器官模型和動(dòng)物模型共同實(shí)現(xiàn)[29]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)很多精神疾病可能是多個(gè)發(fā)育進(jìn)程紊亂導(dǎo)致的大腦發(fā)育異常和環(huán)路異常，如神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的改變，大腦細(xì)胞特定腦區(qū)的遷移以及準(zhǔn)確合適的突觸電生理活動(dòng)等[30-32]。大腦類器官模型可以為研究精神疾病的起源和病理學(xué)提供一個(gè)新的體外模型，在分子和細(xì)胞水平研究精神疾病相關(guān)遺傳變異對(duì)人類大腦發(fā)育和功能的影響。

除此之外，大腦類器官模型也可廣泛用于藥物毒理學(xué)研究和新藥開發(fā)。很多研究表明，精神分裂癥患者的腦體積減少，然而其具體分子學(xué)機(jī)制尚不明確，有研究表明抗精神病藥物可以引起腦體積縮小，也有研究認(rèn)為無法排除疾病自然進(jìn)程的影響[33]。大腦類器官模型可以體外模擬患者大腦的早期發(fā)育和生長過程，因此可以對(duì)類器官使用不同抗精神病藥物進(jìn)行處理，以觀察藥物與腦體積的關(guān)系?？偟膩碚f，大腦類器官在精神疾病病因、病理、治療等研究中顯示了巨大潛力。