間歇性酒精暴露對青少年期小鼠酒精犒賞及焦慮行為的影響☆

黃慧 張曉潔 傅瀟雅 郝偉 向小軍

狂飲在青少年人群中較為常見[1]。研究發(fā)現(xiàn)間歇性酒精暴露（adolescent intermittent ethanol exposure，AIE）能較好地模擬青少年狂飲，經過AIE處理的大鼠，酒精消耗量增加，焦慮水平升高[2-3]。然而研究結果并不一致，部分研究報道AIE雖然能增強大鼠對酒精的犒賞效應，但降低焦慮水平[4-5]。C57BL/6小鼠對酒精存在天然偏好，較容易形成穩(wěn)定的酒精條件性位置偏愛 （conditioned place preference，CPP）[6]，也是焦慮行為相關研究中頻繁用到的動物[7]。目前AIE研究多以大鼠為實驗對象，缺乏小鼠的研究，AIE對小鼠酒精犒賞效應及焦慮行為的作用尚不明確。故本研究擬在青少年期C57BL/6小鼠中通過AIE建立狂飲模型，利用酒精CPP評價酒精犒賞效應，使用高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）實驗測試其焦慮水平，以探討青少年狂飲對酒精犒賞及焦慮行為的影響，以期為青少年狂飲的早期干預提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物100只SPF級4周齡健康雄性C57BL/6小鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。小鼠適應性飼養(yǎng)1周，動物飼養(yǎng)間內溫度（23±1）℃，濕度 55%±5%，小鼠自由進食及飲水。

1.2 實驗流程本研究由兩部分實驗構成。實驗1，將20只小鼠隨機分成AIE組及NS組，每組10只，一組接受AIE處理，一組接受生理鹽水處理；24 h后2組小鼠均行酒精的CPP實驗。實驗2，另取80只小鼠經EPM測試后，分為高、低焦慮組（20只/組），中間水平焦慮小鼠淘汰；高、低焦慮組中再分別隨機分為AIE組、NS組 （10只/組），分別接受AIE處理或生理鹽水處理；24 h后，4組小鼠再次行EPM測試。在實驗2中，高焦慮NS組及低焦慮NS組各死亡2只小鼠，故最終只有8只小鼠的數(shù)據(jù)納入分析。

1.3 實驗方法

1.3.1 AIE方法 利用AIE模擬青少年狂飲。AIE方法參照VETRENO等[8]的研究：小鼠腹腔注射25%酒精（3 g/kg），連續(xù)給藥 2 d 后，停止 2 d，后繼續(xù)給藥2 d，再停止2 d，即在小鼠出生后36 d、37 d、40 d、41 d、44 d、45 d、48 d、49 d 時腹腔注射酒精，一共給藥8次，總耗時16 d。生理鹽水處理即按照上述流程給予小鼠等體積生理鹽水腹腔注射。

1.3.2 CPP實驗 利用CPP實驗評價酒精的犒賞效應。CPP裝置及分析系統(tǒng)購自上海吉量軟件科技有限公司。該裝置由4個CPP箱組成，4只小鼠可同時進行CPP實驗。每個CPP箱由兩側箱體及中間箱構成，左側箱體為黑白橫條紋及網(wǎng)格底板，右側箱體為黑白豎條紋及橫杠底板。中間箱較狹窄，與兩側箱體之間有活動擋板隔斷，可根據(jù)實驗需要開啟或關閉。裝置自帶紅外傳感器，能自動記錄小鼠的活動情況，并將數(shù)據(jù)傳輸至分析系統(tǒng)。實驗方法參照VALLOF等[9]的研究。第1天進行預適應，將中間箱擋板取出，小鼠從中間箱放入，小鼠在CPP裝置中自由活動30 min。第2天進行預測試，將中間箱擋板取出，小鼠從中間箱放入，小鼠在CPP裝置中自由活動15 min，記錄其在兩側箱體中停留的時間，選擇停留時間較短一側箱體作為小鼠CPP訓練的伴藥側，即CPP訓練時給予酒精后小鼠放入的一側，記錄預測試伴藥側停留時間。訓練（第3～10天）：將中間箱擋板放入，左右兩側箱體與中間箱隔斷，第3、5、7、9天上午8點，小鼠分批次腹腔注射20%酒精（2 g/kg，12.5 mL/kg）后隨即放入伴藥側活動 50 min；第 4、6、8、10 天上午8點，小鼠分批次腹腔注射等體積生理鹽水（12.5 mL/kg）后隨即放入非伴藥側活動50 min。測試（第11天）：末次訓練24 h后，將中間箱擋板取出，小鼠從中間箱放入，小鼠在CPP裝置中自由活動15 min，記錄小鼠在伴藥側停留的時間。CPP值（單位：s）為測試時伴藥側停留時間與預測試時伴藥側停留時間之差。若測試伴藥側停留時間比預測試伴藥側停留時間顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義，則說明小鼠形成酒精CPP。

1.3.3 EPM實驗及分組 利用EPM實驗評估小鼠的焦慮行為。實驗流程參照吳冰潔等[10]的研究，上午8點小鼠轉運到行為學實驗室專用臨時籠架，適應環(huán)境30 min；之后，小鼠面朝EPM開放臂，放置于開放臂與閉合臂接合處，自由活動5 min。記錄開放臂及閉合臂停留時間，計算開放臂時間比（the percentage of time spent in the open arms，OT%），OT%=開放臂時間/（開放臂時間+閉合臂時間）×100%。高、低焦慮小鼠分組標注參照HUANG等[11]的研究：根據(jù) OT%的第 25百分位數(shù)（P25）及第75百分位數(shù)（P75）將小鼠分為低焦慮組（OT%≥P75）和高焦慮組（OT%≤P25），其余小鼠（P25＜OT%＜P75）均被淘汰。

1.4 統(tǒng)計學方法用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。實驗1中，測試伴藥側停留時間與預測試伴藥側停留時間的比較采用配對t檢驗，CPP值組間比較采用獨立樣本t檢驗。實驗2分別在高、低焦慮組中，前后兩次開放臂時間比在AIE組和NS組間比較采用重復測量方差分析。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 實驗1小鼠酒精CPP值實驗1中，AIE組小鼠測試和預測試伴藥側停留時間分別為（401.6±20.9）s和（285.5±14.3）s，前者較后者延長（t=4.502，P=0.001）；NS組小鼠測試和預測試伴藥側停留時間分別為（352.0±12.6）s 和（281.2±14.1）s，前者較后者延長（t=2.504，P=0.041）。AIE 組和 NS組 CPP值分別為（116.1±12.9）s 和（70.8±14.8）s，AIE 組CPP 值比 NS 組更高（t=2.274，P=0.035）。

2.2 實驗2小鼠處理前后開放臂時間比實驗2中OT%經重復測量方差分析，對于高焦慮小鼠，時間主效應 （F=1.952，P=0.181）、AIE分組主效應（F=0.250，P=0.624）及二者的交互作用（F=0.098，P=0.759）均無統(tǒng)計學意義。對于低焦慮小鼠，時間主效應有統(tǒng)計學意義（F=12.199，P=0.003），AIE 分組主效應（F=1.910，P=0.186）及二者的交互作用（F=1.648，P=0.218）無統(tǒng)計學意義。 見表 1。

表1 高、低焦慮小鼠在AIE或NS處理前后EPM實驗開放臂時間比（OT%）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與NS組相比，AIE組CPP值更高，提示AIE促進青少年期小鼠酒精CPP的形成，青少年狂飲可能會增加酒精使用障礙的患病風險。該結果與既往在大鼠研究中的結果相一致[2-3，12-13]，說明狂飲對酒精犒賞效應的促進作用可能與動物品系無關。既往研究進一步發(fā)現(xiàn)，AIE能誘導青少年大鼠杏仁核區(qū)組蛋白甲基化[2]或乙?；痆10]，或前額葉組蛋白乙?；痆3]，進而導致其酒精消耗量增加。說明青少年期大鼠狂飲可能會導致某些腦區(qū)組蛋白修飾發(fā)生改變，進而增加酒精覓藥行為及飲酒量，促進酒精使用障礙的發(fā)生和發(fā)展，但其中的分子生物學機制仍需深入探索。

本研究還發(fā)現(xiàn)，AIE處理不改變高、低焦慮小鼠的焦慮水平，提示AIE對小鼠酒精CPP的促進作用與焦慮無關。該結果與既往以Wistar大鼠或SD大鼠為實驗對象的研究結果相一致[14-15]。MARCO等[15]報道，青少年期Wistar大鼠經AIE處理后使用EPM測量其焦慮水平，發(fā)現(xiàn)其與對照組無差異，該結果在CIPPITELLI等[14]研究中得到驗證。另外，PANDE等[12]發(fā)現(xiàn)，給予青少年期SD大鼠AIE處理后進行黑白箱實驗及EPM測試，也發(fā)現(xiàn)其焦慮水平不變。本研究在AIE處理后24 h再次測量小鼠的焦慮水平，即停止酒精攝入后24 h，小鼠處于酒精戒斷期，而青少年期小鼠對酒精戒斷所致焦慮不敏感[16]，故焦慮水平不發(fā)生明顯改變。另一個可能原因是，本研究的酒精劑量不足以使小鼠在停止飲酒24 h后出現(xiàn)戒斷癥狀，因此不會出現(xiàn)焦慮水平升高，在今后的研究中，需要設置不同劑量酒精來加以證實。此外，AIE實驗中酒精給藥方式可能也會影響動物的焦慮水平：本研究酒精的給藥方式為腹腔注射，小鼠焦慮水平不變；有研究通過口服給予酒精，結果發(fā)現(xiàn)AIE會升高焦慮水平[17]；而通過吸入給予酒精，結果則顯示AIE降低焦慮水平[18]。

本研究初步明確AIE增強小鼠對酒精的犒賞效應，同時不改變小鼠的焦慮水平，提示臨床中應及早對青少年狂飲進行干預，為青少年狂飲的預防及早期干預提供了理論依據(jù)。本研究的不足主要在于缺乏相關分子生物學實驗，未能探討AIE增強酒精犒賞的分子機制，未來將會從組蛋白修飾等方面進一步開展研究。