腫瘤源性外泌體與白血病關系的研究進展

田翔宇，陳奎生

0 引言

白血病是一類造血干祖細胞的惡性克隆性疾病。白血病細胞因增殖失控、分化障礙以及調控受阻等原因而停滯于細胞發(fā)育的不同時期。外泌體（exosomes）是一類由細胞膜和多囊泡體（multivesicular bodies, MVB）融合形成的磷脂雙層膜結構的囊泡小體，可攜帶多種mRNA、蛋白質及微小RNA等，廣泛存在于血液、尿液、唾液等各種體液中[1-2]。隨著近年來研究的不斷深入，發(fā)現外泌體可通過影響細胞增殖、凋亡和自噬、調節(jié)骨髓微環(huán)境、促進血管生成以及抑制骨髓造血等方面促進白血病的發(fā)生發(fā)展，導致白血病的耐藥。同時外泌體也可作為白血病藥物治療的作用靶點。本文就以上幾方面作一綜述。

1 外泌體的生物學特征

外泌體直徑約30～150 nm，密度1.13～1.19 g/ml，外泌體膜上含豐富的膽固醇、鞘磷脂、神經酰胺和脂質。大部分外泌體內含熱休克蛋白（HSP70、HSP90）、四次膜蛋白超家族（transmembrane 4 super family, TM4SF）成員（CD9、CD63、CD81、CD82等）、多囊泡相關蛋白（Alix、TSG-101）及膜轉運融合蛋白（Rab GTPase、lotillin）。另外，外泌體所含蛋白質與細胞來源有關，具有相對特異性，尤其在腫瘤細胞中，外泌體能表達腫瘤相關性蛋白質，例如結直腸癌和卵巢癌來源的外泌體含上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, ECAM），腦腫瘤來源的外泌體表達內皮細胞生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR），從惡性膠質瘤患者血漿中分離得到的外泌體攜帶表皮生長因子受體Ⅲ型突變體mRNA[3-4]，并能作為惡性膠質瘤診斷標志物之一，應用于臨床。

外泌體能被包括B細胞、T細胞、樹突狀細胞（dendritic cell, DC）、血小板、雪旺細胞、心肌細胞、上皮細胞、干細胞和腫瘤細胞在內的體內細胞釋放。在低氧、輻射、氧化應激等刺激下，細胞膜內陷形成內吞小泡，轉運至早期核內體，經過內部酸化等過程，早期核內體發(fā)育為晚期核內體，晚期核內體膜進一步內陷，形成直徑約30～150 nm的多囊泡體，在轉運必需內體復合物（endosomal sorting complex required for transport, ESCRT）參與下，MVB與細胞膜融合，將MVB內的囊泡釋放到細胞外，釋放到細胞外的囊泡即為外泌體[4-5]。

2 腫瘤來源的外泌體在白血病病理進程中的作用

白血病的發(fā)生發(fā)展是一個受到多因素多機制調節(jié)的長期而復雜的過程，其中，白血病細胞分泌的外泌體在這個過程中起著重要作用。

2.1 影響細胞增殖、凋亡和自噬

研究發(fā)現源自人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUCMSCs）的外泌體對細胞增殖具有刺激作用[6]。Shi等[7]發(fā)現在低氧條件下，高表達的miR-486通過靶向作用于Sirt1基因，促進紅白血病TF-1細胞的生長和紅細胞分化。Prieto等[8]發(fā)現在慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）中，白血病細胞所包含的S100-A9蛋白能增強NF-κB活性，促進CLL的進展。Raimondo等[9]研究發(fā)現，在慢性髓系白血?。╟hronic myelogenous leukemia, CML）LAMA84細胞株內或皮下接種LAMA84-外泌體的小鼠體內，LAMA84-外泌體都能夠通過自分泌機制激活抗凋亡途徑，促進CML細胞的增殖和存活。外泌體中的凋亡抑制蛋白（如BCL-2、BCL-XL、MCL-1和BAX）能拮抗細胞凋亡并促進白血病細胞生長[10]。在對伊馬替尼耐藥的K562細胞中，達沙替尼可以抑制Akt/mTOR活性，并下調Beclin-1和Vps34依賴性自噬進而抑制外泌體釋放，最終促進細胞凋亡[11]。Snigirevskaya等[12]通過細胞免疫組織化學分析發(fā)現，在人類白血病U-937細胞凋亡末期，外泌體的蛋白酶體被運輸至U-937細胞中，參與細胞凋亡。

2.2 調節(jié)骨髓微環(huán)境

Corrado等[13-14]發(fā)現LAMA84細胞和CML患者血液釋放含有雙調蛋白的外泌體，并通過雙調蛋白激活表面生長因子受體（EGFR）來調節(jié)骨髓微環(huán)境，為白血病細胞生長和存活提供了適宜的條件。實驗還發(fā)現在HS5骨髓基質細胞和骨髓原代基質細胞中，加入的LAMA84-外泌體可以增加EGFR的磷酸化，并增加Snail基因調控的趨化因子白介素8（IL8）和基質金屬蛋白酶9（MMP9）的表達，這說明外泌體可以參加EGFR信號轉導途徑。此外該研究顯示，LAMA84-外泌體與HS5骨髓基質細胞共培養(yǎng)后膜聯蛋白A2-mRNA表達增加，促進LAMA84細胞對HS5基底膜的黏附。CML細胞釋放的外泌體刺激骨髓基質細胞產生趨化因子IL8、激活趨化因子受體1（CXCR1）和CXCR2下游的多個信號通路，促進惡性白血病基因表達。Feng等[15]用第六代miRCURYTM LNA陣列（v.16.0）進行了K562細胞和K562細胞衍生的外泌體-miRNA微陣列分析，觀察到K562細胞-外泌體能選擇性表達miRNA，通過基因本體論（Gene Ontology, GO）和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）分析，發(fā)現外泌體能增加CML細胞與骨髓微環(huán)境的黏附來促進CML的發(fā)展。Asano等[16]通過TaqMan低密度陣列分析發(fā)現在停用絡氨酸激酶抑制劑后，出現肌肉骨骼疼痛的CML患者循環(huán)中的外泌體源的miR-140-3p升高，并追蹤深層分析發(fā)現骨痛緩解的患者體內外源性miR-140-3p下降。研究發(fā)現miR-140-3p上調可能抑制了肌肉特異性跨膜蛋白Myomarker的表達，導致CML患者的肌肉骨骼疼痛。從而證實了外泌體源miR-140-3p在氣道平滑肌細胞和靶向標記的肌肉特異性跨膜蛋白中具有炎性反應相關的生物學功能。Paggetti等[17]研究發(fā)現CLL的發(fā)病機制與腫瘤相關微環(huán)境和免疫系統功能障礙密切相關。在原代CLL細胞和小鼠白血病模型中，外泌體被內皮細胞和間充質干細胞積極吸收，并將外泌體源的蛋白質和miRNA轉移到靶細胞中誘導炎性反應，其類似于癌相關成纖維細胞，能夠促進白血病細胞生存。因此，外泌體誘導基質細胞向癌相關成纖維細胞轉化，基質細胞又能促進炎性反應細胞因子的增殖、遷移和分泌，從而提供有利于CLL細胞生存的微環(huán)境，內皮細胞攝取外泌體可增加血管生成，從而促進CLL的發(fā)展。

2.3 促進血管生成

外泌體中的蛋白質和miRNA介導細胞間信號轉導，促進血管生成，參與白血病進展。Fang等[18]發(fā)現急性早幼粒細胞白血病細胞產生了大量易被內皮細胞攝取的細胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）（包括外泌體），從而促進血管生成。CML細胞可通過外泌體源miR-21和miR-126穿梭進入內皮細胞，其中miR-21能直接靶向作用于RhoB/Rho GTP酶及RhoA，參與細胞生長調節(jié)、細胞信號轉導和細胞骨架重組過程，從而影響內皮細胞的血管生成能力。外泌體源miR-126被人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）攝取，靶向作用于HUVECS中的CXCL12和VCAM3’-UTR mRNA，減弱LAM84細胞的運動及其對血管內皮的黏附[19]。Umezu等[20]將K562細胞源外泌體與HUVECs共培養(yǎng)，用TaqMan低密度芯片檢測到外泌體源miR-92a過表達，作用于靶基因整合素α5，促進了內皮細胞遷移和血管形成。CML細胞產生的外泌體還能誘導細胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1以及趨化因子IL8表達增加，引起內皮細胞運動性增強，促進血管生成。外泌體還能使內皮細胞表面的VE-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白減少，破壞內皮完整性，刺激血管再生[21]。Mineo等[22]發(fā)現CML細胞株K562細胞釋放的外泌體通過Src信號通路（Src磷酸化）促進血管生成。

2.4 抑制造血

Hornick等[23]發(fā)現急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia, AML）細胞產生的外泌體對造血干細胞/祖細胞（hematopoietic stem cell/progenitor cell, HSPC）有直接抑制作用。研究發(fā)現在AML細胞及攜帶AML移植瘤的裸鼠血漿中，分離提取的外泌體含有大量miR-150和miR-155。將血漿外泌體與HSPC共培養(yǎng)，發(fā)現外泌體源miR-150和miR-155能抑制參與HSPC分化和增殖的轉錄因子c-MYB編碼的轉錄產物的翻譯，抑制集落形成，從而抑制造血。Huan等[24]發(fā)現外泌體可作為腫瘤微環(huán)境的旁分泌調節(jié)劑。在AML小鼠模型中，外泌體通過下調基質細胞中的造血干細胞的關鍵維持因子SCF和CXCL12間接影響造血功能。研究還發(fā)現c-Kit+祖細胞中的轉錄因子c-Kit，c-Myb、Hoxa9、E2f3和Ship1與骨髓基質中的SCF和CXCL12表達均減少。因此，AML外泌體通過基質直接或間接抑制了造血功能。

2.5 介導免疫逃逸和抗白血病免疫

研究表明，腫瘤來源的外泌體對白血病細胞以及免疫細胞的調節(jié)作用具有雙重性。一方面，腫瘤來源的外泌體通過特異性表達CD34、TGF-β1等信號分子下調NK細胞表面受體表達抑制白血病免疫，另一方面，還能通過將其所含抗原呈遞給CTL，誘導抗白血病免疫。

Hong等[25]利用免疫磁珠技術分離AML細胞株Kasumi-1和健康志愿者血漿來源的外泌體發(fā)現，Kasumi-1外泌體特異性表達CD34，AML CD34+外泌體和非CD34+外泌體分別通過下調自然殺傷細胞（natural killer cell, NK）表面受體NKG2D和NKp46表達，抑制免疫。進一步研究表明，表達TGF-β1的AML外泌體與NK細胞共培養(yǎng)后，NK細胞NKG2D表達下調，提示攜帶TGF-β1的外泌體能通過下調NK細胞表面NKG2D抑制腫瘤免疫[26]。然而，研究者通過TEM和Western blot分析急性早幼粒白血?。╝cute promyelocytic leukemia, APL）細胞株NB4來源的外泌體發(fā)現，NB4外泌體能表達視黃酸受體α（retinoic acid receptor α, RARα）、細胞黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）和HSP70；通過外泌體與DC共同誘導的細胞毒性T細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）比僅通過DC誘導的CTL對NB4細胞殺傷力更強，表明外泌體可能通過ICAM-1和Hsp70將抗原呈遞給DC細胞，發(fā)揮抗白血病作用[27]。

3 外泌體與免疫治療

外泌體具有組織特異性，不同來源的外泌體具有不同的生物活性，免疫細胞分泌的外泌體常能誘導細胞產生免疫應答，如活化的NK細胞分泌的EVs通過激活靶細胞的半胱天冬酶途徑，對癌細胞產生細胞毒性，在腫瘤免疫中起重要作用[28]。TGF-β1低表達的外泌體靶向作用于DC，促進DC成熟，從而誘導有效的抗白血病免疫，該靶向作用將為白血病提供新的免疫治療思路[29]。同時，外泌體可作為運載工具通過搭載mRNA、miRNA、非編碼RNA、線粒體RNA以及相應的藥物分子，起到免疫治療的作用。Bellavia等[30]發(fā)現含有IL3-Lamp2B以及被伊馬替尼修飾的外泌體，能夠在皮下接種LAMA84細胞的NOD/SCCID小鼠中特異性靶向作用于腫瘤細胞，使腫瘤變小。目前許多研究表明，藥物能通過作用于外泌體從而改變白血病的發(fā)生發(fā)展。Taverna等[19]發(fā)現在CML細胞中，具有抗癌作用的姜黃素可通過上調外泌體源的miRNA-21穿梭入內皮細胞及miRNA-21靶向作用于RhoB3s’-UTR mRNA來抑制血管新生。姜黃素也可通過減弱外泌體促血管生成作用和調節(jié)內皮屏障，從而減少血管生成。Mineo等[22]發(fā)現加入了達沙替尼的K562細胞，總外泌體的釋放減少了，從而減弱了K562細胞的運動性。K562細胞產生的外泌體能夠誘導達沙替尼敏感的Src磷酸化，進一步活化HUVECs中下游的Src通路蛋白，從而增加血管生成活性。近年來，隨著外泌體相關研究的不斷深入，針對外泌體的腫瘤靶向治療的新方法可能為腫瘤患者帶來新的選擇。

4 腫瘤來源的外泌體作為生物標志物

由于不同親本細胞源外泌體攜載的信息分子不同，在生理和病理情況下，外泌體攜載的信息分子也不同，在病理情況下，外泌體的分泌量增加，且外泌體理化性質穩(wěn)定[31-32]，從體液中獲取外泌體是非侵入性操作。因此，外泌體被認為是生物標志物的理想來源。在血液惡性腫瘤患者的血清中發(fā)現較大濃度的外泌體，它攜帶親本細胞源的特異性膜蛋白，而在正常對照者的血清中很少檢測到外泌體[33]。白血病源外泌體攜帶的信息分子隨病程不同而變化，CML的自然病程分為3期：慢性期、加速期和急變期。根據CML源外泌體攜帶的miR-150、miR-155、miR-221和miR-1246的表達水平，能夠有效地區(qū)分CML病程[34]。miR-150和CD19與CLL不良預后相關[35]；CLL源外泌體攜載miR-155的表達量與患者對FCR化療方案（氟達拉濱、環(huán)磷酰胺和利妥昔單抗）的療效相關；miR-155低表達的患者對化療能產生完全應答，而高表達的患者不能產生完全應答，提示預后較差。AML患者在化療的不同階段，AML源外泌體富載TGF-β1，3種TGF-β1形式（TGF-β1前導肽、非活性肽和成熟TGF-β1）的表達水平不同，其在病情好轉后表達下調[26]。Wojtuszkiewicz等[10]報道，AML源外泌體富載的凋亡相關分子MCL-1、Bcl-2、Bax和Bck-X是輔助診斷、療效觀察、預后判斷以及復發(fā)預測的有用指標[36-37]。另外，AML源外泌體攜帶的信息分子如miRNA可作為AML的微創(chuàng)早期生物標志物，從而發(fā)現微小殘留病灶，及時調整治療方案以及預防復發(fā)。但外泌體作為標志物在臨床應用，尚需要探索簡便、快捷的獲取方法。

5 腫瘤來源的外泌體與白血病耐藥

研究證實外泌體在實體瘤中可以參與腫瘤耐藥的調節(jié)，而外泌體在白血病耐藥中的作用研究相對較少。Crompot等[38]利用CLL細胞與分離出的EVs共培養(yǎng)，分別測定了細胞凋亡、活力、遷移和化學敏感度，結果發(fā)現骨髓基質細胞產生的EVs使CLL-B細胞自發(fā)凋亡或藥物誘導的細胞凋亡減少、細胞耐藥性增加、遷移能力增加以及基因表達增強，其中涉及B細胞受體途徑的基因如CCL3/4、EGR1/2/3和MYC增加。細胞外泌體在CLL-B細胞/骨髓微環(huán)境的溝通中，起到了至關重要的作用。Fei等[39]通過將急性B淋巴細胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL）細胞與小鼠骨髓基質細胞共培養(yǎng)發(fā)現，小鼠骨髓基質細胞可將凝集素半乳糖結合蛋白-3（Galectin-3,Gal-3）包裹于外泌體中，并傳遞給B-ALL細胞，從而顯著提高Gal-3水平。而Gal-3與細胞耐藥密切相關，它可以保護B-ALL細胞逃避尼洛替尼和長春新堿的攻擊，并通過Erk信號通路和NF-κB信號通路來誘導ALL細胞耐藥。細胞耐藥性的發(fā)生是復發(fā)難治性AML患者的主要死因。有學者發(fā)現，AML耐藥株細胞可以以外泌體為載體，通過傳遞抗凋亡相關蛋白復合物參與基因調控，例如NPM1蛋白。而NPM1與AML的發(fā)生密切相關，NPM1的過表達可增加細胞抗凋亡能力[40]。另外，有多項研究表明，耐藥是導致多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）復發(fā)的關鍵所在，Bandari等[41]報道當用BTZ、卡非佐米或美法侖作用于骨髓瘤細胞時，骨髓瘤細胞衍生的外泌體明顯增多，其表達增加的乙酰肝素酶可降解細胞外基質，造成腫瘤細胞的增殖和轉移以及血管生成，促進骨髓瘤的進展，最終導致患者復發(fā)。因此研究外泌體與白血病耐藥的關系是臨床研究的創(chuàng)新點之一。

6 展望

腫瘤來源的外泌體攜帶特異性的腫瘤細胞信息分子，是發(fā)現生物標志物、探索疾病進程及發(fā)病機制的重要窗口。在白血病進程中，白血病細胞分泌的外泌體可通過影響白血病細胞的增殖和凋亡、調節(jié)骨髓微環(huán)境、影響血管生成及直接或間接抑制造血等途徑，促進白血病的發(fā)生和發(fā)展，還能作為白血病的生物標志物，檢測白血病的發(fā)生和病情變化，目前相關研究仍相對較少，未來可進一步在不同白血病細胞株中研究外泌體是否具有相同的標志物特性。有研究報道外泌體參與白血病的耐藥調控，但有關外泌體與白血病的耐藥機制及靶向治療方面的研究仍相對空白。未來，以外泌體及其miRNA為出發(fā)點的白血病耐藥機制及靶向治療研究，可作為新的前進方向。綜上所述，在白血病診斷、治療及監(jiān)測病情發(fā)展過程中，外泌體是一個潛力巨大的媒介，但要使其在臨床上發(fā)揮作用，還需要很多努力。