腸道菌群在針灸治療缺血性腦卒中的作用研究*

馬繼紅，彭擁軍△，孫建華，蘆 蕓，朱冰梅

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院,四川 成都 610041)

在中國，缺血性腦卒中(Ischemic stroke,IS)的治療除了嚴(yán)格按照指南規(guī)定外，中醫(yī)傳統(tǒng)的針灸療法也充分發(fā)揮了其優(yōu)勢(shì)作用，并且在臨床治療上也取得了良好的治療效果[1]。然而，針灸對(duì)于IS治療的作用機(jī)制是復(fù)雜的，目前尚不完全被人們所認(rèn)知。在最新的一系列研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群與IS的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸預(yù)后有著緊密的聯(lián)系，腸道菌群及其產(chǎn)物直接參與了血小板活性的激活及血栓的形成[2]，可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，降低免疫炎癥反應(yīng)，促進(jìn)缺血損傷組織及神經(jīng)功能修復(fù)[3]?；诋?dāng)前研究，本研究深入剖析了腸道菌群及其介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)與IS的相關(guān)性，并探討針灸通過調(diào)控腸道菌群-免疫炎癥反應(yīng)促進(jìn)損傷恢復(fù)的可行性。

1 腸道菌群失調(diào)與IS的相關(guān)性

正常人體腸道內(nèi)棲息著龐大的微生物群體，其數(shù)量和種類繁多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是體細(xì)胞總數(shù)的10倍之多，被稱為“人類第二基因組”。根據(jù)腸道菌群對(duì)宿主的作用可分3類:生理性有益菌群、致病菌群、機(jī)會(huì)菌群，其中有益菌群作為優(yōu)勢(shì)菌占絕大多數(shù)(99%～99.9%)，存在宿主特異性。根據(jù)菌群門類則可分4個(gè)門類：厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門等[4-6]。生理?xiàng)l件下，定植于宿主腸道內(nèi)的菌群處在相對(duì)平衡和穩(wěn)定的狀態(tài)，對(duì)機(jī)體的健康有著十分重要的意義。

腸道菌群與IS的研究是近年來卒中領(lǐng)域新興熱點(diǎn)研究，根據(jù)當(dāng)前研究顯示，腸道菌群在IS的發(fā)生及預(yù)后中發(fā)揮重要作用，且對(duì)卒中患者的具體作用是復(fù)雜多樣的，包括直接參于血小板激活、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成；以及間接對(duì)卒中相關(guān)危險(xiǎn)因素(如高血脂、高血壓、糖尿病等)的影響[7-10]。Swidsinski等[11]通過對(duì)卒中患者的腸道菌群進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)卒中患者腸道中的常駐菌和致病菌在發(fā)生腦卒中后均出現(xiàn)變化。范文濤等[12]通過使用Roche/45高通量測(cè)序?qū)ψ渲泻笠钟舭Y患者大便標(biāo)本中16S RNAV3區(qū)進(jìn)行定性分析發(fā)現(xiàn)，卒中后抑郁癥患者腸道微生態(tài)環(huán)境中細(xì)菌群落的多樣性和均衡性與正常人群存在明顯差異，特征性表現(xiàn)為潛在致病菌腸桿菌科構(gòu)成比例顯著增加而抗炎性細(xì)菌減少，該研究證實(shí)患者腸道菌群狀態(tài)與卒中后抑郁狀態(tài)之間具有內(nèi)在關(guān)聯(lián)[13]。游超等[14]對(duì)腦梗死患者和健康人的糞便中細(xì)菌DNA進(jìn)行分析后也發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者腸道菌群發(fā)生顯著改變(P<0.01)，腸道中機(jī)會(huì)致病菌腸桿菌科、韋榮球菌科和鏈球菌科等顯著增加，而常駐菌如普氏菌屬和擬桿菌屬等顯著減少。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，4周后腦梗死患者腸道菌群結(jié)構(gòu)開始趨向于對(duì)照組，但伴隨菌群多樣性的顯著下降(P<0.05)。有關(guān)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注小鼠糞便菌群多樣性減少、普雷沃氏菌相對(duì)豐度下降,菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,且與缺血區(qū)神經(jīng)元損傷、細(xì)胞凋亡相關(guān)[15]。而最新的研究中，給予重癥腦卒中患者腸內(nèi)營養(yǎng)液中添加雙歧桿菌輔助治療后，患者糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌等數(shù)量顯著多于對(duì)照組，大腸桿菌、腸球菌和小梭菌顯著少于對(duì)照組，說明雙歧桿菌可以有效的調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，增強(qiáng)卒中患者腸道免疫力，從而降低并發(fā)癥的發(fā)生，繼而促進(jìn)卒中患者的恢復(fù)[16]。

2 免疫炎癥反應(yīng)與IS的相關(guān)性

IS的病因病機(jī)十分復(fù)雜，而其中免疫炎癥反應(yīng)被激活在整個(gè)發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。與興奮性毒性作用和氧化、亞硝化作用相比，缺血性腦卒中后免疫炎癥反應(yīng)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，從快速損傷期到恢復(fù)期，免疫反應(yīng)均參與其中。免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以通過多種方式控制機(jī)體對(duì)自體抗原的主動(dòng)應(yīng)答,防止其對(duì)損傷組織的過度免疫反應(yīng)。其中,調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg細(xì)胞)對(duì)主動(dòng)免疫力的抑制是維持免疫穩(wěn)態(tài)和減輕炎癥損傷的關(guān)鍵之一[17]。Treg細(xì)胞表達(dá)CD25+CD4+表面抗原，因而被稱為CD25+CD4+Treg細(xì)胞。在不同的內(nèi)環(huán)境條件下CD4+T細(xì)胞可以分化為不同類型的細(xì)胞，有輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th細(xì)胞)1、Th2、Th17以及誘導(dǎo)性Treg細(xì)胞[18]。固有免疫系統(tǒng)中CD25+CD4+Treg的減少誘導(dǎo)自身免疫性疾病,但重建這種細(xì)胞群體可防止疾病發(fā)展[19]。最新大量研究顯示，CD25+CD4+Treg和Th17細(xì)胞介導(dǎo)的外周免疫反應(yīng)在缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制扮演重要作用。

2.1 缺血性卒中后的免疫激活

腦卒中后的免疫反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)演變的過程，其中，主要參與的免疫炎癥細(xì)胞有腦常駐小膠質(zhì)細(xì)胞和血液源性白細(xì)胞[20]。研究報(bào)道，固有小膠質(zhì)細(xì)胞激活是腦梗后炎癥反應(yīng)的第一步[21]，IS發(fā)生數(shù)分鐘后，局部腦組織及神經(jīng)元細(xì)胞因缺血壞死釋放大量的損傷相關(guān)蛋白，如高活動(dòng)性組蛋白、趨化因子、白介素33熱休克蛋白、三磷酸腺苷等，免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，局部損傷腦組織中促炎因子上調(diào)，這些損傷相關(guān)的蛋白分子與其下游受體-Toll樣受體結(jié)合引起中樞固有免疫細(xì)胞如常駐小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，導(dǎo)致血腦屏障破壞，外周免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)向中樞侵潤(rùn)聚集，聚集至中樞的免疫細(xì)胞通過多種方式影響神經(jīng)元，包括直接殺傷神經(jīng)元或間接釋放炎性因子,促進(jìn)興奮性毒性作用，或活化巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等，進(jìn)一步加重腦損傷[22-23]。

2.2 缺血性卒中的免疫調(diào)節(jié)干預(yù)

在缺血腦組織中有大量的T淋巴細(xì)胞募集,其中以CD4+輔助性T細(xì)胞數(shù)量為主。IS發(fā)生后外周血中的Treg細(xì)胞進(jìn)入顱內(nèi)，導(dǎo)致外周血中Treg細(xì)胞減少,而腦組織中Foxp3(Treg分化調(diào)節(jié)劑)表達(dá)增加。楊雙文等[24]研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈缺血小鼠在缺血/再灌注早期腦水腫逐漸加重，梗死病灶的體積不斷擴(kuò)大，在12 h,Treg細(xì)胞比例開始下降，而1天時(shí)Treg細(xì)胞降至最低，之后開始逐漸恢復(fù)，而在第5天時(shí)又明顯增加。這一趨勢(shì)變化與腦組織病理改變過程相一致。陳瑞清等[25]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后1天，腦組織中Foxp3啟動(dòng)表達(dá)，在腦缺血組的全腦中均可見Foxp3表達(dá)為陽性，而正常對(duì)照組腦組織中則Foxp3表達(dá)為陰性，說明急性腦缺血可引起全身性的適應(yīng)性免疫反應(yīng)且在腦缺血后1天時(shí)Treg細(xì)胞開始參與到IS的免疫調(diào)節(jié)中。此外，研究表明在急性腦梗死患者的外周血中Th17細(xì)胞、IL-17A水平均增高,而IL-17A是由Th17細(xì)胞分泌的，是多種炎癥相關(guān)疾病的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，其水平的升高多與患者神經(jīng)功能缺損有相關(guān)性[26]。Dolati S等[27]發(fā)現(xiàn),腦缺血患者外周血Treg細(xì)胞比例及Foxp3表達(dá)水平降低,而Th17細(xì)胞比例上升,而這種變化與IL-17A的表達(dá)相關(guān)，提示IS發(fā)生后外周血中Th17細(xì)胞比例的增加和Treg細(xì)胞比例的減少是加重腦損傷的關(guān)鍵因素。

3 針灸通過調(diào)控“腸道菌群-免疫反應(yīng)”治療IS可行性

3.1 腸道菌群介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)與IS的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)

胃腸道淋巴組織是機(jī)體免疫細(xì)胞最大的棲息地，腸道菌群寄生于腸道內(nèi)，是機(jī)體最豐富的共生者。正常情況下，機(jī)體內(nèi)腸道優(yōu)勢(shì)菌群和免疫系統(tǒng)保持動(dòng)態(tài)平衡，但是當(dāng)機(jī)體發(fā)生胃腸功能障礙時(shí)，腸道內(nèi)寄生的細(xì)菌大量增殖，破壞了腸道的免疫屏障，引發(fā)機(jī)體腸道免疫反應(yīng)，嚴(yán)重影響病人的預(yù)后[28-29]。Telesford等[30]回顧了有關(guān)腸道菌群及其對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)腸道菌群能夠影響全身免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的分泌,主要機(jī)制是通過促炎性Th1和Th17產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，以對(duì)抗抗炎性Th2型免疫反應(yīng)。相關(guān)研究表明，在IS的腦損傷時(shí)，腸道菌群失調(diào)能夠直接影響免疫細(xì)胞，主要是影響Treg細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞，而兩者均參與IS的腦損傷過程[31]。其中，γδT細(xì)胞大部分存在于腸道上皮表面[32]，具有固有免疫作用。腸道菌群紊亂，γδT細(xì)胞分泌大量IL-17并引起周圍的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，進(jìn)而加重對(duì)IS的損傷[33-34]。Benakis等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在克拉維酸敏感以及不敏感的大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠模型中，通過對(duì)敏感的MCAO小鼠進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)3周的治療后，將其糞便移植到克拉維酸不敏感的MCAO小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過糞便移植的克拉維酸不敏感MCAO小鼠腦梗死面積較未經(jīng)糞便移植的小鼠減少了54%。導(dǎo)致這一結(jié)果主要是由于IL-17+γδT細(xì)胞的減少和Treg細(xì)胞增加，限制了IL-17+γδT的細(xì)胞炎性物質(zhì)進(jìn)入腦膜。由此可見，在IS的發(fā)生、發(fā)展過程中，腸道菌群和IL-17+γδT細(xì)胞發(fā)揮重要作用。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在急性腦損傷后期的缺血組織中發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞，其分泌大量抗炎細(xì)胞因子(IL-10)，IL-10通過抑制IL-17+γδT細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的效應(yīng)[36]。然而，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在卒中急性期時(shí)未發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移的Treg細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，說明Treg細(xì)胞是通過調(diào)節(jié)外周免疫系統(tǒng)繼而發(fā)揮保護(hù)作用[37]。

3.2 針灸對(duì)腸道菌群失調(diào)及免疫炎癥反應(yīng)有良好的調(diào)節(jié)作用

3.2.1 調(diào)控腸道菌群 一直以來便秘、腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、腸應(yīng)激綜合征等胃腸道疾病都是針灸臨床的優(yōu)勢(shì)、有效病種，以此為基礎(chǔ)的研究也充分證實(shí)了針灸對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)和分泌具有良好的調(diào)節(jié)效應(yīng)[38-40]。并且相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示，針灸可提高胃腸的免疫，即通過針刺和艾灸等手法能增加血清中免疫球蛋白濃度，增強(qiáng)腸道局部免疫，產(chǎn)生保護(hù)腸道黏膜的作用[41]。

近年來，更多的研究者開始關(guān)注針灸對(duì)胃腸道中菌群的調(diào)節(jié)作用，大量的研究也發(fā)現(xiàn)，針灸可以有效的調(diào)控腸道菌群。針灸療法可以通過不同的選穴配伍、操作方法等改善腸道菌群的多樣性和有益菌的數(shù)量，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)機(jī)體功能、發(fā)揮治療的作用。例如，針刺便秘型腸易激綜合征(IBS)患者相應(yīng)腧穴，可使腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌數(shù)量增加，大腸埃希菌數(shù)量減少[42-43]。而在對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠腸道菌群的研究中發(fā)現(xiàn)，UC大鼠腸道菌群豐度及多樣性較對(duì)照組顯著降低，且致病菌含量明顯增高，實(shí)驗(yàn)通過電針UC大鼠的天樞、足三里、上巨虛穴，大鼠腸道菌群的豐度值及多樣性明顯提高，提示其可能因針灸相關(guān)腧穴可起到調(diào)整腸道菌群有關(guān)[44]。在最新的研究中，張博等[45]通過對(duì)100例慢性UC患者進(jìn)行隨機(jī)分組研究發(fā)現(xiàn)，針灸聯(lián)合中藥治療后觀察組的腸道菌群改善情況優(yōu)于對(duì)照組(均P<0.05)，且Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg比值顯著降低，Treg細(xì)胞比例顯著升高，觀察組上述細(xì)胞比例改善情況優(yōu)于對(duì)照組(均P<0.05)，提示其可能與改善腸道菌群失調(diào)、促進(jìn)Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡從而抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，隔藥灸天樞與氣海穴可以提高UC大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌含量，同時(shí)降低大腸桿菌和枯草桿菌的含量，其主要機(jī)制可能為隔藥灸調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群、抑制TNF-α和IL-12的表達(dá)、調(diào)節(jié)腸道的免疫應(yīng)答作用[46]。

3.2.2 調(diào)控免疫炎癥反應(yīng) IS發(fā)生后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是腦缺血損傷的重要原因之一，而針灸對(duì)缺血發(fā)生后的免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用無論在實(shí)驗(yàn)研究還是臨床研究都已被證實(shí)。在免疫炎癥的過程中，調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞對(duì)主動(dòng)免疫力的抑制是維持免疫穩(wěn)態(tài)和減輕炎癥損傷的關(guān)鍵。臨床研究發(fā)現(xiàn)[47]，針刺可明顯改善卒中患者CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平，改善機(jī)體細(xì)胞免疫功能，提高腦卒中患者運(yùn)動(dòng)功能及日常生活活動(dòng)能力，縮短病程。并且根據(jù)前人的研究分析發(fā)現(xiàn)，針灸可以抑制缺血再灌注大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，調(diào)控缺血腦組織中細(xì)胞炎性因子釋放。例如，研究發(fā)現(xiàn)[48]，電針缺血再灌注模型大鼠的曲池、足三里，可以通過調(diào)節(jié)TLR4(Toll樣受體40)/NF-КB信號(hào)通路、降低炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，從而改善神經(jīng)功能缺損、減少梗塞面積。倪光夏等[49]運(yùn)用RT-PCR方法,觀測(cè)急性局灶性腦缺血再灌注大鼠不同時(shí)間點(diǎn)病變側(cè)大腦皮層的白細(xì)胞介素-1(IL-1RI)和腫瘤壞死因子受體I(TNFR-I)表達(dá)情況，以及針刺對(duì)上述觀測(cè)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用規(guī)律發(fā)現(xiàn)，針刺降低了大鼠腦缺血再灌注后大腦皮層異常升高的IL-1RI和TNFR-I，進(jìn)而對(duì)腦損傷起保護(hù)作用。陳素輝等[50]發(fā)現(xiàn)，在IS急性期，針刺百會(huì)和足三里穴可通過調(diào)節(jié)TNF-α的過度表達(dá)，減輕腦缺血損傷大鼠腦組織的炎癥反應(yīng)。劉丹等[51]在觀察雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎的慢性腦缺血大鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，督脈電針可以通過調(diào)節(jié)大鼠缺血腦組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)缺血損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)，該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，與缺血形成后治療相比，早期督脈電針治療效果更好。

4 小結(jié)

腦缺血發(fā)生的應(yīng)激環(huán)境下，腸道菌群及其介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡，可能加重缺血腦組織的損傷，而通過糾正腸道菌群微生態(tài)失調(diào)，降低免疫炎癥反應(yīng)，可能促進(jìn)IS損傷后的腦組織及神經(jīng)功能恢復(fù)。目前，關(guān)于針灸調(diào)控腸道菌群的研究多集中在肥胖、腸易激綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎等方面，而關(guān)于針灸調(diào)控腸道菌群在IS方面的研究確不多。雖然腸道菌群介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)對(duì)IS后損傷的恢復(fù)的作用已經(jīng)引起越來越多研究者的重視，而且大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證明了針灸療法在調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫炎癥反應(yīng)中的作用。但針灸通過調(diào)節(jié)“腸道菌群-免疫反應(yīng)”對(duì)IS的治療在卒中領(lǐng)域的有關(guān)研究結(jié)果尚不明確,因此，今后應(yīng)多方面深入探究腸道菌群介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)在治療IS患者方面的應(yīng)用，為針灸治療缺血性腦卒中提供新思路、新靶點(diǎn)。