重樓屬植物規(guī)范化生產(chǎn)種植的研究概況Δ

劉 斌，邵美玲，楊光義，楊 洋，馮光軍#

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院藥學部，湖北 十堰442000； 2.深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院藥學部，廣東 深圳 518000)

重樓為百合科植物七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.或云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.的干燥根莖[1]。重樓藥用歷史悠久，具有較高的藥用價值，其味苦，性微寒，有小毒，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚之功效，主要用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蛇蟲咬傷、跌撲傷痛和驚風抽搐等[2-3]。重樓屬植物在全世界有28種[4]，在我國有19種18變種，其資源主要分布于西南各省區(qū)(云南省、四川省及貴州省)[5]，目前分布較廣的品種是七葉一枝花和云南重樓[6]。歷版《中華人民共和國藥典》收載的重樓基源植物均為七葉一枝花和云南重樓[1]。重樓主要的活性物質(zhì)為甾體皂苷，主要成分有甾醇、甾醇苷、黃酮苷及C21孕甾烷型苷等多種化合物，還含有多種氨基酸和微量元素[7-8]。重樓的藥理作用體現(xiàn)在對機體多個系統(tǒng)都具有影響，具體可用于子宮出血、泌尿系統(tǒng)感染、外科炎癥、惡性腫瘤及避孕等方面[9-10]。重樓藥用價值高，在臨床得以廣泛應(yīng)用，是云南白藥制劑、季德勝蛇藥片及宮血寧膠囊等多種名貴中成藥的重要組方藥物，市場需求量大。而藥用重樓主要依靠野生資源，利益的追求導(dǎo)致近年來我國大部地區(qū)野生重樓都遭到過度采挖，致使野生資源愈發(fā)趨于枯竭，每年的消耗量遠遠超出了其年生長量[11-12]；加之市場需求的不斷擴大，規(guī)范化種植成為必然選擇。重樓為多年生草本植物，生長周期緩慢，從出苗到藥用需要5～8年，有胚后熟的特性，種苗繁殖率低，資源再生緩慢[6]。如何縮短重樓生長周期，在較快的時間內(nèi)使其品質(zhì)達到藥用標準，加快重樓栽培繁育技術(shù)研究是緩解供需矛盾的關(guān)鍵，也是迫切需要解決的關(guān)鍵問題。但目前對于重樓的栽培繁育技術(shù)及規(guī)范化種植技術(shù)都尚未取得令人滿意的結(jié)果，制約了重樓的產(chǎn)業(yè)化進展，進行重樓的栽培繁育研究與原生態(tài)規(guī)范化種植技術(shù)研究迫在眉睫。查閱歷代本草和現(xiàn)代文獻發(fā)現(xiàn)，近幾十年來國內(nèi)外學者多關(guān)注重樓的藥理作用和臨床應(yīng)用的研究，而對重樓的規(guī)范化規(guī)范化生產(chǎn)種植關(guān)鍵技術(shù)缺少系統(tǒng)性的研究。因此，針對當下野生重樓資源瀕臨枯竭的現(xiàn)狀，需要及時有效地對這些研究動態(tài)及特點進行分析總結(jié)，以為下一步的重樓規(guī)范化生產(chǎn)種植提供基礎(chǔ)。現(xiàn)根據(jù)重樓藥材規(guī)范化生產(chǎn)種植過程中所涉及到的種質(zhì)資源、組織培養(yǎng)技術(shù)、化學成分和藥理作用、藥材質(zhì)量控制及品質(zhì)評價等方面的內(nèi)容，分別作如下總結(jié)。

1 重樓的種質(zhì)資源調(diào)查和品種鑒定

重樓為多年生草本植物，其根可入藥，因在每輪葉片之上還有一輪葉片狀花萼擬為2層綠葉，故名重樓。重樓藥用歷史悠久，以“蚤休”之名首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[13]，列為下品，是臨床常用中藥；《唐本草》曰：“今謂重樓者是也，一名重臺，南人名草甘遂，一莖六七葉，似王孫、鬼臼、蓖麻輩，葉有二三層，根如肥大菖蒲，細肌脆白”；又曰：“根摩醋，傅癰腫蛇毒，甚有效”；《日華子本草·蜀本草》稱重樓為“螫休”[14]；《本草圖經(jīng)》稱之為“紫河車”[15]；《本草蒙筌》稱之為“七葉一枝花”?！侗静菥V目》云：“一層七葉，莖頭夏月開花，一花七瓣……蟲蛇之毒，得此治之即休，故有蚤休、螫休諸名”[16]；《植物名實圖考》中曰：“蚤休通呼草河車，亦曰七葉一枝花，為外科要藥”。以上所述，與現(xiàn)今之重樓相符，歷版《中華人民共和國藥典》予以收載。重樓生長條件較苛刻，在歐亞大陸的溫熱帶區(qū)域分布較廣，據(jù)資料記載，重樓屬植物在歐亞大陸的地理分布和遺傳多樣化中心是以橫斷山脈南段為核心區(qū)域的四川、云南2省，作為藥源的重樓是側(cè)膜亞屬的種，集中分布于西南地區(qū)云南、貴州和四川3省[5]。目前，我國重樓的人工規(guī)范化生產(chǎn)種植基地多集中于云南省等地區(qū)，種植品種多為云南重樓。本課題組充分利用湖北省西北地區(qū)的地理和氣候條件優(yōu)勢，分別在武當山(伏龍山龍王寨)和神農(nóng)架(木魚鎮(zhèn)千家坪)選取野生重樓植株分布密集的生長環(huán)境作為種植示范基地，并發(fā)展林下仿野生生態(tài)種植示范基地，面積達400余畝，每畝種植收益為10萬～16萬元，也是帶動山區(qū)百姓脫貧致富的穩(wěn)妥可靠的項目，在上述地區(qū)顯現(xiàn)出了極大的價值。

重樓的人工栽培和種植過程中，由于種植人員缺乏對物種的鑒定，常出現(xiàn)種植品種不確定或同一片藥田中多種重樓混種的現(xiàn)象，成熟采收后均作為重樓藥材流入市場，嚴重影響重樓藥材的質(zhì)量。目前，重樓種植最廣泛的品種為云南重樓和華重樓，但經(jīng)常與毛重樓和長藥隔重樓混種混用，主要由于其莖都顯綠色或紫色，葉形都呈披針形、倒披針形，其差別主要在于花和果實，難以辨別區(qū)分。由于重樓種屬繁多，且不同種屬重樓的根莖形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)相似，非專業(yè)或未經(jīng)過相關(guān)培訓(xùn)的人士很難鑒別。而不同種屬重樓所含成分及含量有較大差別[17-18]。僅以原植物形態(tài)特征(形態(tài)、大小及色澤等)、藥材性狀和顯微鑒定等傳統(tǒng)鑒定方法或《中華人民共和國藥典》所述含量(水分、灰分及皂苷含量等)來鑒定重樓種屬的難度較大，因此，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上建立快速、有效的鑒定重樓的方法十分必要。

中藥的使用必須建立在品種確定、質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，因此，中藥鑒定是確定品種及控制質(zhì)量的前提，更可為擴大和尋找藥源提供幫助。近年來，生物分類和鑒定的研究熱點DNA分子標記技術(shù)可以彌補和克服傳統(tǒng)中藥鑒定方法的一些缺陷和難題，在物種鑒定等方面有廣闊的應(yīng)用前景[19]。DNA條形碼(DNA barcoding)是選用標準短的DNA 片段對物種進行快速準確的自動化鑒定和識別[20]。加拿大動物學家Paul Hebert首先提出將DNA條形碼技術(shù)引進生物的鑒定中[21]。該技術(shù)通過比較DNA條形碼，從已知物種的參考序列庫中查詢未知樣本進行真核生物的識別和鑒定[22-23]。研究結(jié)果表明，從遺傳、有效成分、化學含量和生態(tài)因子等方面對藥用植物的道地性進行研究，可以證明化學成分含量、生長環(huán)境因素與內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(internal transcribed spacer 2，ITS2)序列的遺傳距離相關(guān)[24]。張曉瑞等[25]實驗結(jié)果表明，同一種重樓所生長的地理位置越接近，其相對遺傳距離就越小，反之則差異越大，得出結(jié)論，生長區(qū)域環(huán)境是重樓遺傳變異及進化趨勢的主要影響因素。DNA條形碼為重樓屬藥用植物的鑒別開辟了一條新途徑，ITS2作為DNA條形碼序列能有效區(qū)別不同種屬重樓，這在實現(xiàn)規(guī)范化生產(chǎn)種植操作規(guī)程中可用于種質(zhì)、種源的正確鑒定和篩選，并能起到監(jiān)控作用[26]。

2 重樓栽培技術(shù)研究進展

重樓各種屬雖遍布歐亞地區(qū)，但傳統(tǒng)上只有在我國入藥，我國上市藥品有多種成藥以重樓為原料，僅云南、四川及廣東3省的藥品生產(chǎn)企業(yè)需求量就超過700噸，供需矛盾尖銳[27]。古來已久的重樓繁育方式為種苗繁育，因此，種苗繁育對于中藥材野生資源的補充、人工規(guī)范化種植及我國中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都有著很重要的作用。重樓種子成熟時易剝離且產(chǎn)量大，理論上種子的有性繁殖可以提供大量種苗，但由于重樓種子具有“二次休眠”的生理特性，且出苗率極低，導(dǎo)致大量種子在漫長的休眠期內(nèi)喪失了生命力[28]。

重樓種子具有胚后熟、生長周期長和對環(huán)境要求高的特性，且重樓種子紅皮含抑制植物生長的化合物，不利于種子萌發(fā)，這些都增加了重樓種植的難度。目前，重樓的種苗繁育方法主要有種子繁殖、根莖切塊繁殖和組織培養(yǎng)，重樓種子的休眠機制決定了在實際生產(chǎn)中只能以帶頂芽切段繁殖為主[29]。植物的細胞全能性是組織培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)，也是當下最能快速高效解決重樓無性繁育瓶頸的途徑之一[30]。唐榮華[31]在實驗中通過選取重樓的花和葉進行組織培養(yǎng)，未能產(chǎn)生愈傷組織，且3個月后全部失去活力；李群等[32]在篩選外植體時發(fā)現(xiàn)，重樓莖葉和花蕾都不能誘導(dǎo)出愈傷組織，也不能誘導(dǎo)出小球莖，證明了不同外植體的誘導(dǎo)頻率差異很大；楊麗云等[33]將云南重樓的芽作為外植體進行滅菌處理，然后接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基形成了完整的重樓植株；王躍華等[34]通過選取生長狀況良好的黑籽重樓根莖，成功進行了重樓愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖。本課題組采用高溫和低溫交替組合結(jié)合植物生長調(diào)節(jié)劑的方法，打破了重樓種子“二次休眠”的生理特性，解決了重樓種子繁殖周期長、萌發(fā)率低的問題；采用激素處理重樓根莖的環(huán)紋切口技術(shù)，實現(xiàn)了重樓根莖的無性快速繁殖等。

目前，我國規(guī)范化生產(chǎn)種植基地實際主要使用的種苗繁育方法還是種子與根莖快速繁殖方法，種子繁殖周期較長，一般都直接以根莖繁殖，目前該方法成熟穩(wěn)定，可以保證種植的重樓經(jīng)濟效益良好。當前重樓的組織培養(yǎng)研究進展較緩慢，由于其自身的組織細胞脫分化能力較低、細胞分裂速度慢，同時在組織培養(yǎng)過程中還存在條件(繁殖體選擇、消毒及培養(yǎng)基等)的篩選等限制，使得該技術(shù)還未能在實際種植中得到廣泛應(yīng)用，今后仍需加大對重樓組織培養(yǎng)技術(shù)的研究力度。

3 重樓的化學成分和藥理作用研究進展

重樓根莖呈結(jié)節(jié)狀扁圓柱形，長5～8 cm，寬1.0～3.5 cm，表面黃棕色或灰棕色，外皮脫落處呈白色密具層狀突起的粗環(huán)紋，粉性，氣微，味微苦、麻。我國學者對重樓屬植物的化學成分研究，于1962年初次從重樓中分離出甾體皂苷成分開始。此后，隨著國內(nèi)外學者研究的深入，相繼報道了甾體皂苷、蛻皮激素及萜類等各類化合物，目前已從重樓根莖中提取出50余種化合物，主要有甾體皂苷、離氨基酸、甾醇、β-蛻皮激素、多糖及黃酮等[35]。將提取化合物進行分離得到多種皂苷，其主要苷元為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元[36]；但不同種屬重樓中皂苷含量及比例差異明顯，對重樓的14個種及變種的化學成分進行分析得到200多種化合物，其中甾體皂苷121 個、三萜皂苷18個，所有被研究過的種和變種，都分離得到了甾體皂苷[37-39]。重樓中提取出的化合物的活性成分主要為甾體皂苷，占總化合物的80%以上，其中薯蕷皂苷元、偏諾皂苷元為主要苷元[40]。

重樓作為我國常用的傳統(tǒng)中藥材，一直以根莖入藥。目前，針對重樓化學成分的研究主要側(cè)重于其甾體類成分、氨基酸類成分及無機元素等，藥理作用體現(xiàn)在止血、抗腫瘤、抗菌、抗炎、大腦和腎保護等[10]。科研人員已證明重樓的水、甲醇和乙醇提取物都具有明顯的抗腫瘤作用[41]，在肝癌[42]、肺癌[43]、胃癌[44]、前列腺癌[45]、鼻咽癌[46]和結(jié)腸癌[47]等的治療中均能起到抗腫瘤作用，重樓皂苷還具有抗肺癌轉(zhuǎn)移作用[48]。重樓苦寒降瀉，有廣譜抗菌作用，在臨床上被廣泛用于支氣管肺炎、尿路感染、口腔感染及痤瘡等各種感染性疾病的治療[49-51]。研究結(jié)果證實，重樓水醇提取物對甲型流感病毒和亞洲甲型流感病毒有較強的抑制作用；重樓煎劑對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腦膜炎雙球菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌均有不同程度的抑制作用；黃芪重樓湯治療兒童支氣管肺炎的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中藥具有保護呼吸道黏膜上皮和肺血管內(nèi)皮細胞、抑制肺炎支原體生長、改善微循環(huán)和調(diào)節(jié)免疫功能等功能[52]；重樓去脂甲醇提取物可使凝血時間明顯縮短；采用大鼠溫水甩尾實驗、痛行為評分法和β-內(nèi)啡肽、促腎上腺皮質(zhì)激素的放射免疫分析，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷可阻斷急性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成，現(xiàn)有研究結(jié)果也已表明重樓有顯著的鎮(zhèn)靜作用，其強度等同于或略強于地西泮[53]。綜上可見，重樓藥用價值極高，臨床應(yīng)用范圍也越來越廣泛，市場需求必將巨大，加大對重樓屬植物化學成分及藥理作用的深入研究有重要價值和意義。

4 重樓質(zhì)量控制和品質(zhì)評價

我國上市藥品中有46種中成藥以重樓為原料，中成藥藥效是藥材中多成分相互作用的結(jié)果，僅憑單個或某幾種物質(zhì)化學成分的含量高低難以全面反映藥材的質(zhì)量，質(zhì)量的不確定性一直是限制中藥走向世界的瓶頸。因此，中藥質(zhì)量的標準化是很有必要且迫切需要的，也是中藥走向現(xiàn)代化、國際化的出路。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，中藥質(zhì)量控制的技術(shù)和方法不斷發(fā)展，中藥質(zhì)量標準也不斷豐富，從以前單成分、單指標的質(zhì)量控制到如今多成分、多指標的質(zhì)量控制轉(zhuǎn)變。從中藥整體而言，建立一種中藥特征指紋圖譜將能較為全面地反映中藥所含化學成分的種類與數(shù)量，進而對中藥質(zhì)量進行科學有效的描述和評價。因此，建立重樓的特征圖譜鑒別方法，將能更全面、科學地評價重樓的質(zhì)量。現(xiàn)代儀器分析手段是重樓質(zhì)量控制的主要手段，目前用于重樓質(zhì)量控制的主要方法包括色譜法如薄層色譜法[54]、氣相色譜法[55]及高效液相色譜法[56]等，還有光譜法(如紫外、紅外光譜法等)、核磁共振譜和聯(lián)用技術(shù)(如氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法及高效液相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù))等方法[57-59]。

甾體皂苷是重樓藥材及其復(fù)方制劑質(zhì)量控制的指標性成分[60]?！吨腥A人民共和國藥典：一部》(2015年版)[1]中，已將重樓皂苷Ⅰ(C44H70O16)、重樓皂苷Ⅱ(C51H82O20)、重樓皂苷Ⅵ(C39H62O13)和重樓皂苷Ⅶ(C51H82O21)的總含量作為重樓含量測定的指標成分；其他標準為：水分不得超過12.0%，總灰分不得超過6.0%，酸不溶性灰分不得超過3.0%，含量測定按干燥品計算，4種皂苷總含量不得低于0.60%。但是，目前對重樓的質(zhì)量評價標準仍缺乏規(guī)范統(tǒng)一的工藝技術(shù)參數(shù)，系統(tǒng)研究不同種類重樓中有效成分含量的影響，對于確定重樓藥材質(zhì)量的優(yōu)異以保證重樓的臨床療效具有重要意義。隨著科技的發(fā)展，近年來對重樓藥理作用的研究不斷深入，重樓的應(yīng)用范圍日益廣泛，其臨床價值越發(fā)重要，因此，制定一套規(guī)范、完整的質(zhì)量控制體系是重樓臨床療效得以保證的基礎(chǔ)和前提。

在規(guī)模化種植過程中，重點要解決中藥規(guī)范化、規(guī)?；推放苹汝P(guān)鍵技術(shù)問題。目前，主要是利用現(xiàn)代分析檢測技術(shù)，對特色中藥材進行質(zhì)量評價研究。主要內(nèi)容包括來源、性狀、鑒別、檢查、浸出物、高效液相色譜含量測定、炮制方法與原理等的全方位研究，促進中藥材質(zhì)量穩(wěn)定、可控。根據(jù)地區(qū)特色中藥材的生物學特性和基地條件，進行播種或定植方法、密度及耕作技術(shù)和病蟲害防治(包括利用生物農(nóng)藥防治病蟲害)的綜合治理研究；對地區(qū)特色中藥材生長期內(nèi)的各指標成分積累和含量的動態(tài)變化進行研究，確定其最佳采收期；對產(chǎn)地加工、衛(wèi)生包裝及倉儲條件進行研究，制定地區(qū)特色中藥材規(guī)范化種植標準操作規(guī)程，建立特色中藥材優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)模式。

5 結(jié)論

綜上所述，《中華人民共和國藥典》(2015年版)收載的重樓藥用品種為七葉一枝花和云南重樓，但在實際用藥中，并未嚴格區(qū)分品種，加上各地參照質(zhì)量標準不一，導(dǎo)致了重樓藥材品質(zhì)良莠不齊。究其根本，是因為重樓品種繁雜，生長周期較長，植物繁殖率低，資源再生較慢，再加上逐年掠奪式采挖造成的生長環(huán)境嚴重破壞，導(dǎo)致重樓野生資源急劇減少，少部地區(qū)甚至瀕臨枯竭。目前使用較廣的塊莖繁殖雖然相對較快，但易致不同品種混種，藥農(nóng)在采挖野生重樓過程中也沒有進行有效區(qū)分，無法判斷是否為《中華人民共和國藥典》(2015年版)中規(guī)定的品種，很多藥材收購商也不具備鑒別真?zhèn)蔚哪芰?，造成當下我國中藥材市場上存在中藥品種不純正、摻假造假等多種現(xiàn)象，影響了中藥材的臨床療效和安全。野生重樓生長條件苛刻，生長于較高海拔背陰山地，喜陰濕，在疏松肥沃、土層深厚和排水良好的砂質(zhì)壤土中生長良好。因此，保護重樓植物資源，加強質(zhì)量控制和監(jiān)管，實行重樓的規(guī)范化生產(chǎn)種植，是推進重樓藥材及其他中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。

重樓植物根莖生長緩慢，生長環(huán)境對重樓的品質(zhì)和產(chǎn)量影響較大，重樓次生代謝產(chǎn)物累積規(guī)律、影響重樓有效成分含量的因素分析和重樓林下原生態(tài)栽培技術(shù)規(guī)程中眾多參數(shù)等關(guān)鍵技術(shù)亟需解決；此外，在重樓栽培技術(shù)推廣模式創(chuàng)新和重樓新產(chǎn)品開發(fā)等方面仍需繼續(xù)深入探索和開發(fā)?？梢酝ㄟ^建立林下基地選擇指標體系、基地建設(shè)與生物多樣性保護、種子與根莖快速繁殖方法、病蟲害防治技術(shù)、專用肥開發(fā)及重樓藥材質(zhì)量評價體系建立等關(guān)鍵技術(shù)和進行規(guī)范化種植，并推廣應(yīng)用“產(chǎn)學研”發(fā)展模式，有利于解決重樓藥材的供需矛盾，培育特色的中藥種植產(chǎn)業(yè)，優(yōu)化調(diào)整山區(qū)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，兼顧經(jīng)濟、社會和生態(tài)三大效益，實現(xiàn)地區(qū)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。