谷氨酰胺酶新型抑制劑及其抗腫瘤活性研究進(jìn)展*

廖英 冀林華 綜述 崔森 審校

腫瘤發(fā)生及癌細(xì)胞增殖與代謝重編程密切相關(guān)，癌細(xì)胞可通過(guò)改變營(yíng)養(yǎng)素的攝取和分解代謝協(xié)調(diào)代謝重編程，使其能夠維持增殖能力，增強(qiáng)對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力，并逃避免疫介導(dǎo)的破壞［1］。許多腫瘤細(xì)胞具有“谷氨酰胺成癮”這一特性，并且研究發(fā)現(xiàn)，在靶向藥物治療時(shí)腫瘤細(xì)胞谷氨酰胺代謝代償性增強(qiáng)，可能是腫瘤產(chǎn)生耐藥的一個(gè)潛在因素谷氨酰胺酶（glutaminase，GSL）是谷氨酰胺代謝途徑的關(guān)鍵酶，對(duì)依賴(lài)于谷氨酰胺代謝的腫瘤細(xì)胞抑制其GLS活性，將導(dǎo)致腫瘤代謝途徑的破壞，影響大分子合成、ATP產(chǎn)生和細(xì)胞氧化還原平衡。本文介紹腫瘤谷氨酰胺代謝及GSL 抑制劑作用機(jī)制以及其新型制劑抗腫瘤研究進(jìn)展。

1 谷氨酰胺在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用

癌細(xì)胞即使在有氧情況下也會(huì)將大部分葡萄糖酵解產(chǎn)生ATP 維持其能量需求，即“Warburg 效應(yīng)”。但這一改變使得進(jìn)入三羧酸（TCA）循環(huán)的底物減少，為滿(mǎn)足生物大分子合成的需求，腫瘤細(xì)胞大量攝入谷氨酰胺并在谷氨酰胺酶的作用下將其轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔龠M(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)棣?酮戊二酸（α-KG）以補(bǔ)全TCA循環(huán)，即為“谷氨酰胺酵解”［2］。谷氨酰胺是血液和肌肉中含量最豐富的氨基酸，不僅為各類(lèi)氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸及其他重要生物分子提供前體物質(zhì)和能量，還提供NADPH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）和谷胱甘肽（GSH）以促進(jìn)細(xì)胞增殖并維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)［3］。谷氨酰胺還可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)雷帕霉素復(fù)合物（mTORC1）活性，谷氨酰胺酶活性的提高與癌基因如Myc［4］和Ras［5］上調(diào)以及Rho GTP 酶［6］的過(guò)度活化相關(guān)，通過(guò)驅(qū)動(dòng)致癌因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯、抑制自噬和增強(qiáng)大分子物質(zhì)生物合成而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。

2 谷氨酰胺酶及谷氨酰胺酶抑制劑

2.1 谷氨酰胺酶

GLS是一種線粒體酶，在谷氨酰胺代謝中起著至關(guān)重要的作用。谷氨酰胺由細(xì)胞膜上氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC1A5（也稱(chēng)ASCT2）轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞后，在GLS 催化作用下谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，然后谷氨酸通過(guò)谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為α-KG 并引入TCA 循環(huán)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)有兩種編碼谷氨酰胺酶的基因［7］：谷氨酰胺酶1（GLS1）和肝型谷氨酰胺酶（GLS2），二者由相同基因復(fù)制經(jīng)基因分化而來(lái)，但蛋白結(jié)構(gòu)、涉及的調(diào)節(jié)機(jī)制和動(dòng)力性特征均不同。GLS1 又分為兩個(gè)變種：腎型谷氨酰胺酶和谷氨酰胺酶C（GAC）。GLS1 在許多癌癥類(lèi)型中過(guò)表達(dá)，在一些人類(lèi)癌細(xì)胞中，GLS1活性與c-Myc、Ras 等癌基因表達(dá)呈正相關(guān)，GLS1 水平升高提示更晚的疾病階段和不良預(yù)后。相反，GLS2 則能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［8］，在正常和腫瘤細(xì)胞中，由于GLS2基因啟動(dòng)子中含有可與p53基因結(jié)合的DNA片段，故GLS2 是p53 靶基因。以上均表明谷氨酰胺代謝與惡性腫瘤的發(fā)展存在一定關(guān)系，這一發(fā)現(xiàn)為靶向谷氨酰胺代謝治療癌癥提供了理論基礎(chǔ)。

2.2 谷氨酰胺酶抑制劑

最早發(fā)現(xiàn)的是非競(jìng)爭(zhēng)性谷氨酰胺酶抑制劑：谷氨酰胺類(lèi)似物如6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（DON）和重氮絲氨酸，通過(guò)與許多谷氨酰胺利用酶（包括谷氨酰胺酶）的活性位點(diǎn)不可逆地結(jié)合從而抑制谷氨酰胺酶的活性，但臨床研究顯示這些類(lèi)似物抗腫瘤活性有限，且由于其廣泛的拮抗作用導(dǎo)致的嚴(yán)重毒性進(jìn)一步限制了開(kāi)發(fā)利用。后來(lái)開(kāi)發(fā)的兩種變構(gòu)小分子谷氨酰胺酶抑制劑，化合物968（5-（3-溴-4-（二甲基氨基）苯基）-2，2-二甲基-2，3，5，6四氫苯并［a］菲啶-4（1H）-酮）和BPTES（雙-2-（5-苯基乙酰氨基-1，3，4-噻二唑-2-基）乙基硫醚）毒副作用明顯減小，其通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮作用，被廣泛用于臨床前研究［9］。化合物968 為GLS1 特異性抑制劑，可抑制GSL1 重組表達(dá)，與未激活狀態(tài)的谷氨酰胺酶結(jié)合阻止GSL1 活化，但對(duì)經(jīng)無(wú)機(jī)磷酸鹽激活的谷氨酰胺酶作用效力明顯降低［6］。BPTES是一種有效的、非競(jìng)爭(zhēng)性的特異性GLS1 抑制劑，BPTES 與谷氨酰胺酶結(jié)合使其靠近催化位點(diǎn)的關(guān)鍵環(huán)發(fā)生劇烈構(gòu)象改變從而抑制谷氨酰胺酶活性，而且其活性不受無(wú)機(jī)磷酸鹽影響［10］。然而因BPTES 效力中等、代謝穩(wěn)定性較差以及溶解度低限制了其臨床應(yīng)用潛力。CB-839是一種新型可逆性的非競(jìng)爭(zhēng)性谷氨酰胺酶抑制劑，首先由Le等［11］提出，作用機(jī)制與BPTES相似，但從活性測(cè)定結(jié)果看，CB-839 相對(duì)于BPTES 具有更強(qiáng)的抗腫瘤增殖活性；并且由于CB-839 在BPTES 結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)修飾使其比BPTES 溶解度更大，親和力更強(qiáng)［9］。

3 谷氨酰胺酶新型抑制劑CB-839 抗腫瘤活性研究進(jìn)展

3.1 CB-839抗腫瘤機(jī)制及特點(diǎn)

大部分腫瘤具有“谷氨酰胺成癮”特性，但并非所有腫瘤細(xì)胞均依賴(lài)谷氨酰胺，谷氨酰胺酶與丙酮酸羧化酶之間存在補(bǔ)償關(guān)系，當(dāng)谷氨酰胺濃度較低而丙酮酸作為癌細(xì)胞中補(bǔ)充TCA 循環(huán)的前體物質(zhì)時(shí)，丙酮酸羧化酶進(jìn)行誘導(dǎo)反應(yīng)，此時(shí)腫瘤細(xì)胞更依賴(lài)于葡萄糖而非谷氨酰胺沉默［11］。因此，靶向谷氨酰胺治療腫瘤時(shí)需考慮這種關(guān)系。

谷氨酰胺抑制劑抗腫瘤作用機(jī)制：1）饑餓作用：通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的攝取及利用，從而阻斷腫瘤細(xì)胞能量及前體物質(zhì)來(lái)源。但有研究表明CB-839 治療和谷氨酰胺剝奪的效應(yīng)存在差異［12-13］，說(shuō)明CB-839誘導(dǎo)一組特定的分子效應(yīng)，這些效應(yīng)與通過(guò)從細(xì)胞中提取全部或部分谷氨酰胺誘導(dǎo)的分子效應(yīng)不同。2）破壞細(xì)胞內(nèi)外氧化還原穩(wěn)態(tài)：谷氨酰胺是合成谷胱甘肽和NADPH 的重要前體物質(zhì)，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受活性氧ROS 破壞，維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的氧化還原穩(wěn)態(tài)［14］。3）通過(guò)影響癌基因調(diào)節(jié)腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路：谷氨酰胺可通過(guò)雙向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A5/SLC3A2［15］以及進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的亮氨酸來(lái)激活mTORC1，驅(qū)動(dòng)致癌因子的翻譯，抑制自噬和增強(qiáng)脂質(zhì)生物合成而有利于腫瘤發(fā)生［16］。癌信號(hào)（如c-Myc、Ras 等）和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。致癌基因MYC 是GLUT1、SLC1A5、SLC38A1 和GLS 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，厄洛替尼和CB-839聯(lián)合應(yīng)用不僅降低了腫瘤中MYC 蛋白水平，也相應(yīng)降低其下游靶標(biāo)的蛋白質(zhì)水平［17］。4）抑制細(xì)胞自噬：自噬在癌癥發(fā)生發(fā)展中依賴(lài)環(huán)境發(fā)揮作用：雖然自噬可以通過(guò)去除異常蛋白質(zhì)和損傷細(xì)胞器來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生，其可通過(guò)為既定癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)和存活提供底物來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)［18］。谷氨酰胺可通過(guò)激活mTORC1，抑制AMBRA1和TRAF6的相互作用來(lái)控制ULK1泛素化，從而抑制自噬［19］；此外，由于ROS 是自噬誘導(dǎo)劑，谷氨酰胺還可通過(guò)谷胱甘肽和NADPH 消除ROS 來(lái)抑制自噬［20］。腫瘤細(xì)胞對(duì)CB-839敏感性的相關(guān)因素：1）腫瘤細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的依賴(lài)程度。2）細(xì)胞內(nèi)谷氨酸和谷氨酰胺水平。3）GAC表達(dá)量。

CB-839 對(duì)三陰性乳腺癌［21］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［22］和多發(fā)性骨髓［12］等多種腫瘤均具有抗增殖活性。在膠質(zhì)瘤和白血病中存在異檸檬酸脫氫酶（IDH）高頻突變，IDH突變將影響谷氨酰胺代謝途徑，最終導(dǎo)致染色質(zhì)高度甲基化，這種甲基化影響正常細(xì)胞分化，導(dǎo)致未成熟細(xì)胞增殖，引發(fā)腦部腫瘤發(fā)生［23］。用CB-839處理IDH1 野生型和突變體神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，無(wú)論IDH1突變狀態(tài)如何，CB-839對(duì)更具侵襲性的膠質(zhì)瘤衍生細(xì)胞系抗生長(zhǎng)活性更強(qiáng)［22］。CB-839對(duì)耐藥小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在極低濃度作用下即存在強(qiáng)殺傷作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬作用［24］，靶向谷氨酰胺酶治療還可抑制腫瘤轉(zhuǎn)化［6］。

3.2 CB-839與靶向藥物的聯(lián)合應(yīng)用

靶向治療是在細(xì)胞分子水平上，針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的蛋白分子或基因片段來(lái)設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物通過(guò)與特異性靶點(diǎn)結(jié)合使腫瘤細(xì)胞死亡，而不影響腫瘤周?chē)＝M織細(xì)胞，目前已成為癌癥治療的熱點(diǎn)。但目前應(yīng)用的靶向藥物多針對(duì)致病蛋白或基因形成，且諸多靶向藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞能量代謝的影響多是對(duì)葡萄糖代謝產(chǎn)生抑制，從而忽略谷氨酰胺對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)支持作用。另一方面，靶向治療藥物雖顯示極好的抗腫瘤作用，但在臨床中均不可避免出現(xiàn)腫瘤耐藥這一問(wèn)題，近年為解決惡性腫瘤的耐藥性，逐漸采用聯(lián)合用藥治療方案。通過(guò)選用不同作用機(jī)制的抗癌藥物聯(lián)合給藥，不僅能夠增強(qiáng)藥物療效、減少用藥量，且較大程度地降低了化療藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)及耐藥性，顯著提高治療效果，減輕患者治療時(shí)的痛苦。

CB-839與腫瘤特定靶向治療藥物聯(lián)用顯示出極好的協(xié)同作用。mTOR 是腫瘤細(xì)胞基因突變信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵效應(yīng)物質(zhì)，不僅可以激活下游信號(hào)通路從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、存活和侵襲轉(zhuǎn)移［25］，還可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)特異性激酶靶向治療藥物產(chǎn)生耐藥［26］，mTOR 已成為抗腫瘤的一個(gè)重要靶點(diǎn)。mTOR靶向抑制劑可顯著抑制腫瘤細(xì)胞葡萄糖消耗，但谷氨酰胺酵解代償性增強(qiáng)，GLS 的表達(dá)增加，使腫瘤細(xì)胞能夠在mTOR靶向治療中存活，說(shuō)明GLS可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)mTOR 靶向治療獲得性耐藥，而RNA 干擾下調(diào)GSL表達(dá)或使用CB-839可增加mTOR靶向治療腫瘤細(xì)胞的敏感性，并協(xié)同抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［27］和卵巢癌［28］中均得到證實(shí)。在EGFR 突變肺腺癌、EGFR 突變非小細(xì)胞肺癌［17，29］體外及異種移植模型中，CB839 與EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFRi）聯(lián)用，EGFR 和GLS的雙重抑制誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的能量應(yīng)激，刺激AMPK活化和誘導(dǎo)自噬，引起代謝危象，抗腫瘤作用較單項(xiàng)靶向治療藥物顯著增強(qiáng)。Gregory等［30］研究發(fā)現(xiàn)，與谷氨酰胺酶抑制劑CB-839作用相似，F(xiàn)LT3抑制劑AC220可使FLT3突變的AML細(xì)胞谷氨酰胺攝取減少，而Gallipoli等［31］最近的研究結(jié)果表明FLT3 酪氨酸激酶抑制劑可顯著降低糖酵解，但不影響FLT3 ITD 細(xì)胞中的谷氨酰胺攝取，谷氨酰胺代謝支持酪氨酸激酶抑制劑作用FLT3 ITD細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞線粒體功能和氧化還原穩(wěn)態(tài)。但二者研究結(jié)果均表明當(dāng)CB-839與AC220聯(lián)合使用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺水平顯著下降，相應(yīng)的使抗氧化因子谷胱甘肽產(chǎn)生減少，誘導(dǎo)線粒體活性氧物質(zhì)，并通過(guò)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致活力喪失。在源自患者的異種移植AML小鼠模型中，CB-839促進(jìn)AC220白血病細(xì)胞消除，并顯著改善存活。另外，CB-839 靶向谷氨酰胺代謝可通過(guò)增強(qiáng)蛋白酶體抑制劑（PI）誘導(dǎo)PI耐藥多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的ER 應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)，從而協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中與第二代PI卡菲佐米的協(xié)同作用最強(qiáng)［12］。

CB-839不僅可協(xié)同靶向藥物發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用，在小鼠模型的臨床前研究中也顯示出良好的耐受性，未觀察到體重減輕或毒性［21］。對(duì)于局部晚期、轉(zhuǎn)移性和（或）難治性實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤患者，CB-839正在開(kāi)放式Ⅰ期臨床試驗(yàn)中被評(píng)估（NCT02071862，NCT02071888，NCT02771626）。

4 結(jié)語(yǔ)

代謝途徑相關(guān)酶作為癌癥治療的潛在靶向藥物的研究逐年增加，谷氨酰胺代謝與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，GSL作為谷氨酰胺代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶受到越來(lái)越多的關(guān)注，前期用于諸多腫瘤模型且療效確切。研究者在開(kāi)發(fā)具有代謝穩(wěn)定性、優(yōu)異的藥效學(xué)和選擇性、無(wú)毒的小分子谷氨酰胺酶抑制劑方面投入了大量時(shí)間，CB-839因其分子量小，具有良好的口服生物利用度，時(shí)間依賴(lài)性和緩慢可逆的動(dòng)力學(xué)等諸多優(yōu)勢(shì)從眾多GSL 抑制劑中脫穎而出。除了上述多種腫瘤，CB-839的抗腫瘤作用在腎上皮細(xì)胞［9］、軟組織肉瘤［32］等也得到證實(shí)，目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)研究階段，有望用于臨床中協(xié)同腫瘤化療藥物作用，優(yōu)化組合結(jié)構(gòu)，減少不良反應(yīng)，解決耐藥的難題。