肝細胞癌的免疫治療研究進展*

唐雨豪 王駿成 朱應欽 陳錦濱 張耀軍 周仲國 陳敏山 徐立

時已為晚期，肝切除與局部消融術(shù)的效果有限，需要接受全身性化療、靶向藥物治療等，上述治療手段一定程度上可以延長患者的生存時間，但對肝癌患者的預后改善有限［2］，亟需新的肝癌治療策略。

近年來，隨著腫瘤免疫治療取得一系列突破，肝肝癌在全球最常見的癌癥中位居第六位，在癌癥相關(guān)性死亡中位居第四位。肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）約占原發(fā)性肝癌的75%～85%，過去20年里HCC的發(fā)病率和死亡率不斷增長，是主要的全球健康問題之一［1］。多數(shù)肝癌患者就診癌的免疫治療也得到越來越多的關(guān)注［3］。按照作用機制和免疫治療可分為主動免疫和被動免疫治療（獲得性免疫治療），本文就近年來HCC免疫治療的現(xiàn)狀和研究進展進行概述。

1 主動免疫治療

主動免疫治療是指通過激活腫瘤患者受抑制的免疫系統(tǒng)，使機體產(chǎn)生獲得性免疫力以對抗腫瘤的療法，目前肝癌的主動免疫治療主要包括抗原依賴性免疫治療、非抗原依賴性免疫治療和細胞因子治療等。

1.1 抗原依賴性免疫治療

抗原依賴性免疫治療一般指腫瘤疫苗治療，癌癥免疫治療的首要目標是通過激活先天和適應性免疫反應來促進腫瘤的消除，達到治療腫瘤的目的。目前，有關(guān)HCC的腫瘤疫苗主要包括致敏樹突狀細胞（dendritic cell，DCs）疫苗、多肽疫苗和DNA疫苗。該方法主要采用自體腫瘤細胞或培養(yǎng)的自體腫瘤細胞或異體腫瘤細胞對腫瘤患者進行免疫接種，使患者產(chǎn)生非特異性或抗原特異性免疫反應來發(fā)揮抗腫瘤作用。

DCs是人體內(nèi)功能最強的抗原呈遞細胞，并且在主動免疫和過繼性免疫中發(fā)揮橋梁的作用，是機體免疫反應的始動者，能有效激活初始T細胞，引發(fā)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應，并通過干擾素-γ（interferon，IFN-γ）的釋放抑制腫瘤血管生成［4］。一項Ⅱ期臨床試驗表明，利用肝癌細胞系HepG2裂解產(chǎn)物刺激DCs并進行過繼免疫治療的進展期肝癌患者中，12.7%患者血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平較治療前降低，腫瘤體積縮小，且耐受性良好［5］。在另一項研究中［6］，分別用經(jīng)肝動脈栓塞（transhepatic arterial embolization，TAE）和TAE加DCs疫苗注射20例和13例HCC患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合方法能更有效地增強腫瘤特異性免疫反應。但是在使用DCs疫苗的HCC患者中，僅觀察到有限的臨床結(jié)局改善，兩組的腫瘤復發(fā)率并無差異，這可能與HCC患者的肝臟免疫抑制環(huán)境，以及目前DCs疫苗缺乏特異性HCC靶標抗原相關(guān)［7-8］。盡管DCs疫苗制備過程復雜，但DCs疫苗刺激產(chǎn)生的針對腫瘤細胞的免疫應答可能是可行且積極的策略，而且對于肝癌患者是安全可耐受的腫瘤治療方式，是肝癌術(shù)后一項新的輔助治療方法［9］。

腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigens，TAAs）和腫瘤特異性抗原（tumor specific antigens，TSAs）的發(fā)現(xiàn)和確認使多肽疫苗的設(shè)計更為合理有效，多肽疫苗可誘導機體產(chǎn)生特異性T細胞，明顯促進免疫增強以及腫瘤的消退，目前用于多肽疫苗的TAAs主要包括AFP和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）。最早的HCC多肽疫苗［10］基于AFP特異性的CD8+T細胞表位，外周血檢測顯示接種受試者產(chǎn)生AFP特異性T細胞應答，但后來的Ⅱ期臨床試驗僅檢測到一過性免疫反應。近期一項Ⅰ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)［11］，接受AFP特異性多肽疫苗的15例受試者均未出現(xiàn)不良事件，其中1例受試者腫瘤完全緩解（complete response，CR），8例受試者腫瘤進展減緩。一項GPC3疫苗治療的Ⅰ期臨床試驗招募了33例晚期HCC患者［12］，GPC3疫苗相關(guān)細胞毒T細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）高表達患者和低表達患者的中位總生存期（median overall survival，mOS）分別為12.2個月和8.5個月。

1.2 非抗原依賴性免疫治療

免疫檢查點是抑制免疫系統(tǒng)激活的重要節(jié)點，免疫檢查點受體在腫瘤組織中通常表達上調(diào)，從而幫助腫瘤逃避宿主的免疫監(jiān)測。免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）可以阻斷腫瘤誘導的免疫抑制狀態(tài)，從而增強抗腫瘤免疫［13］。在肝癌治療中，ICIs靶點包括細胞毒性T淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4）、程序性死亡受體-1（programmed death-1 receptor，PD-1）及其配體PD-L1等。

1.2.1 CTLA-4抑制劑 CTLA-4僅在活化的T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）和幼稚T細胞上表達，可競爭性抑制CD80/86-CD28途徑的T細胞激活［14］。CTLA-4抑制劑為最早應用于臨床的ICIs，包括ipilimumab和tremelimumab等，前者最早用于黑色素瘤，而tremelimumab是目前唯一應用于HCC治療的CTLA-4抑制劑，其療效在兩項臨床試驗中得到了評估：一項Ⅰ期研究［15］納入20例HCV相關(guān)的BCLC-C期HCC患者，tremelimumab治療的部分反應率（partial response，PR）為17.6%，疾病控制率（disease control rate，DCR）為76.4%，患者6個月和1年生存率分別為64%和43%。值得注意的是，雖然45%患者出現(xiàn)3～4級丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）升高，但是多出現(xiàn)在第1個療程期間，后續(xù)治療過程中未出現(xiàn)。另外一項Ⅱ期研究觀察了在sorafenib耐藥的HCC患者（BCLC-C期）中使用tremelimumab聯(lián)合局部治療（TACE 和 RFA）的效果［16］，26.3%（5/19）患者可以獲得PR，在治療后第6周的穿刺活檢中，這些臨床獲益的患者腫瘤內(nèi)CD8+T細胞明顯增多。與CTLA-4相關(guān)的免疫相關(guān)的不良事件（immune-related adverse events，irAEs）主要涉及皮膚和胃腸道，其次是肝臟和內(nèi)分泌系統(tǒng)。

1.2.2 PD-1/PD-L1抑制劑 PD-1屬于CD28超家族，主要表達于CD8+T細胞，也在Treg細胞和骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）上有表達，其與配體PD-L1、PD-L2結(jié)合而傳遞T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）的共抑制信號，高水平的PD-1表達可令CD8+T細胞效應功能喪失，并介導Treg細胞的分化和增殖，從而調(diào)節(jié)外周免疫耐受［17-18］。腫瘤細胞可以通過表達PD-L1或PD-L2來激活PD-L1/PD-1信號傳導，從而激活腫瘤浸潤淋巴細胞中的PD-1并逃避免疫監(jiān)視。相關(guān)研究表明，腫瘤中PD-1和PD-L1的表達與HCC分期、局部復發(fā)率和不良預后顯著相關(guān)［19-20］。越來越多的臨床證據(jù)表明，PD-1/PD-L1抑制劑單藥治療是安全、可耐受的，并且在晚期HCC患者中可達10%～20%的客觀緩解率（objective response rates，ORRs）［21］。

Nivolumab是一種針對PD-1的人IgG4單克隆抗體，2017年12月獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于既往接受過sorafenib治療的晚期HCC。在Checkmate 040Ⅰ/Ⅱ臨床研究［22］的劑量遞增試驗（0.1～10 mg/kg）中，nivolumab在治療晚期HCC中顯示出了可控的安全性和可接受的耐受性，僅25%的受試者在該階段顯示3/4級毒性反應（轉(zhuǎn)氨酶、淀粉酶、脂肪酶升高和瘙癢等）。另外，在這一階段的試驗中，nivolumab的ORR為15%，6個月和9個月總生存率均為66%。而在Ⅱ期劑量擴展階段（3 mg/kg），ORR為20%，6個月和9個月總生存率分別為83%和74%。

Pembrolizumab是一種針對PD-1的人源化IgG4單抗，其臨床療效和安全性與nivolumab相似。一項Ⅱ期臨床試驗結(jié)果表明［23］，在sorafenib治療失敗的晚期HCC患者中，pembrolizumab治療的ORR為17%，盡管在73%患者中出現(xiàn)了治療相關(guān)的不良反應，但是3、4級毒性反應發(fā)生率僅為24%和1%，且并未觀察到病毒的再激活或爆發(fā)，轉(zhuǎn)氨酶升高也在預期范圍內(nèi)。pembrolizumab也在2018年11月獲得FDA批準用于晚期HCC的二線治療。針對PD-L1的單克隆抗體durvalumab也在sorafenib治療失敗的晚期HCC患者中取得一定療效：一項納入39例受試者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗顯示ORR為10.3%［24］。對于其他針對PD-1/PD-L1的抑制劑，如avelumab、spartalizumab、atezolizumab和camrelizumab等，目前正在開展HCC患者的臨床試驗。

由于PD-1抑制劑在進展期肝癌患者中已取得一定的臨床獲益，且安全性良好，而目前對于肝癌根治性切除術(shù)后的患者仍缺乏標準輔助治療方案，PD-1單抗單藥或聯(lián)合應用作為肝癌患者根治性切除或消融術(shù)后的輔助治療的研究也成為研究熱點。如nivolumab與安慰劑對照作為輔助治療高復發(fā)風險HCC的全球隨機雙盲Ⅲ期研究（NCT03383458），toripalimab對比安慰劑用于局部晚期肝細胞癌根治術(shù)后輔助治療的Ⅱ/Ⅲ期研究（CTR20182326），camrelizumab聯(lián)合阿帕替尼對于肝癌術(shù)后患者的Ⅱ期臨床研究（NCT03722875）等均已啟動并入選患者，有待進一步研究數(shù)據(jù)披露。

大多數(shù)HCC患者對ICIs單藥治療不能獲得客觀腫瘤反應，部分患者的腫瘤仍會進展或無法獲得持久的控制，各國學者均試圖通過聯(lián)合用藥方案增強ICIs的療效。不同作用機制的ICIs聯(lián)合使用可能會提高患者反應率和抗腫瘤效應，如CTLA-4和PD-1/PD-L1單克隆抗體抑制劑聯(lián)合，可能令阻斷作用相互協(xié)同，提高反應率，改善治療結(jié)果［25-26］。在HCC中，tremelimumab和durvalumab的聯(lián)合使用也初步觀察到一定的療效：反應率為20%（8/40，CR+PR），但不良事件發(fā)生率也較單藥治療有所增加（60%≥1級）［27］。

同時，ICIs與靶向藥物的聯(lián)合理論上可能導致更為迅速的腫瘤反應，并可延長緩解時間，在動物實驗中已觀察到治療反應率的提高［28-29］。目前，正在進行的靶向藥物與ICIs聯(lián)合治療進展期肝癌的臨床研究多達數(shù)十項，包括ICIs與多靶點酪氨酸激酶抑制劑的聯(lián)合方案nivolumab聯(lián)合sorafenib（NCT03439891）、pembrolizumab聯(lián)合regorafenib（NCT03347292）、pembrolizumab聯(lián)合lenvatinib（NCT03006926）、camrelizumab聯(lián)合apatinib（NCT03463876）等。此外，ICIs與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth，VEGF）單抗的聯(lián)合方案nivolumab聯(lián)合bevacizumab（NCT03434379）、atezolizu mab聯(lián)合Bevacizumab（NCT）等。以上聯(lián)合用藥方案中，pembrolizumab聯(lián)合lenvatinib及atezolizumab聯(lián)合bevaci zumab的早期數(shù)據(jù)報道客觀反應率達到25%以上，不良反應可控，被認為是最有希望的組合［30-31］，相關(guān)的Ⅲ期臨床研究正在進行中，結(jié)果值得期待。

1.3 細胞因子

細胞因子是由免疫細胞及其相關(guān)細胞合成分泌的一類低分子蛋白或糖蛋白的大家族，目前用于HCC治療的細胞因子包括干擾素（interferon，IFN）、白介素（interleukin，IL-2）等，其中關(guān)于IFN的研究相對成熟。

IFN分為IFN-α、IFN-β和IFN-γ，既往多用于治療病毒性肝炎［32］，研究證實三類IFN均可促進HCC細胞凋亡［33-35］。IFN-α可能改善HCC患者根治性切除術(shù)后的預后，IFN-α組與對照組的中位無病生存時間（median disease-free survival，mDFS）分別為31.2個月和17.7個月（P=0.142），mOS分別為63.8個月和38.8個月（P=0.000 3）［36］。IFN-α也可以聯(lián)合化療藥物，如肝動脈灌注5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）聯(lián)合皮下注射IFN-α用于合并門脈癌栓的晚期HCC，早期CR率和PR率分別可達3.5%和69.5%［37］。Obi等［38］報道，在IFN-γ和5-FU聯(lián)合治療116例伴門靜脈侵犯肝癌患者中，19例（16%）患者治療反應可達到CR，42例（36%）患者可達到PR，總體的6、12和24個月累計生存率分別為53%、34%和18%。但由于IFN對HCC患者的確切療效與高毒性率的爭議，該方案不宜作為可推廣的標準治療方案。有研究發(fā)現(xiàn)［39］，低表達miR-26與患者對IFN治療高反應相關(guān)，或可作為是否采用IFN治療決策的重要依據(jù)。

IL-2具有多種生物學功能，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮中心作用。IL-2能刺激自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）、T細胞以及淋巴因子激活的殺傷細胞（lymphokine activated killer cell，LAK）的增殖和活性，從而引起抗腫瘤效應。2016年和2017年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南推薦高劑量IL-2作為轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的二線治療［40］和Ⅳ期透明細胞為主型腎細胞癌的一線治療［41］，但高劑量的IL-2在HCC患者中常導致嚴重的不良反應。低劑量IL-2治療的耐受性較好，但并無足夠的臨床試驗證明能夠有效延緩HCC進展［13］。

2 被動免疫治療

被動免疫治療是指給患者輸注外源的免疫效應物質(zhì)以發(fā)揮特異性免疫作用治療腫瘤，相較于主動免疫并不依賴機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫抗體。過繼性細胞療法（adoptive cell therapy，ACT）則是HCC被動免疫治療的最主要方式，其利用癌癥患者自身具有抗腫瘤活性的淋巴細胞，通過細胞因子刺激、體外培養(yǎng)或行腫瘤抗原負載，使其中具有抗腫瘤活性的免疫細胞大量擴增，再回輸至患者體內(nèi)達到直接殺傷腫瘤細胞的目的。目前，研究較多的ACT包括有細胞因子誘導殺傷細胞（cytokine-induced killer cell，CIK）、嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）、NK細胞、抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）等［42］。

2.1 細胞因子誘導殺傷細胞

CIK是具有不同TCR特異性效應細胞的混合細胞群（包括CD3+CD56+、CD3+CD56-和CD3-CD56+細胞），具有針對腫瘤細胞的非MHC限制的細胞毒活性，能夠識別腫瘤抗原并直接殺死癌細胞［43］。研究發(fā)現(xiàn)在HCC根治性治療后使用CIK細胞輸注輔助治療可以達到一定的生存獲益：一項Ⅲ期臨床研究［44］納入230例根治性治療后的HCC患者（手術(shù)切除、RFA或經(jīng)皮乙醇注射術(shù)），接受免疫治療的患者（每次輸注6.4×109CIK，接受16次/60周治療）的中位無復發(fā)生存（median recurrence-free survival，mRFS）時間相較未接受免疫治療的患者更長（44.0個月vs.30.0個月，P=0.010），雖然CIK組患者的不良事件率更高（62%vs.41%，P=0.002），但是兩組出現(xiàn)嚴重不良事件的頻率并無顯著性差異（P=0.15）。另一項系統(tǒng)性綜述［45］分析了7項RCT和9項非RCT臨床試驗，這些研究中CIK治療均作為HCC常規(guī)治療（手術(shù)治療、RFA和TACE）后的輔助治療，結(jié)果表明CIK輔助治療可以明顯提高OS，并可降低術(shù)后復發(fā)率（P＜0.001）。

2.2 CAR-T細胞

CAR-T細胞是目前腫瘤ACT治療的重要進展和研究熱點。CAR-T細胞技術(shù)通過整合嵌合抗原基因修飾的T細胞來靶向攻擊腫瘤。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors，CAR）含有單克隆抗體的抗原結(jié)合部分和與效應受體信號傳導相關(guān)的共刺激和信號結(jié)構(gòu)域，可以特異性地識別TAA，進而引起T細胞的激活和增殖［46］。目前，主要的HCC相關(guān)CAR抗原包括GPC3、黏蛋白-1（mucin-1，MUC-1）VEGF-A、上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM）以及病毒抗原等。

有研究［47］設(shè)計了分別具有CD28和CD137共刺激信號結(jié)構(gòu)域的GPC3-CAR-T細胞，體外試驗發(fā)現(xiàn)前者有更高的細胞毒性，而后者則可以誘導更明顯的CAR-T細胞擴增?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，目前一系列驗證GPC3-CAR-T的療效和安全性的臨床試驗已經(jīng)展開或正在招募患者。盡管CAR-T細胞療法的安全性在轉(zhuǎn)移性HCC患者中已經(jīng)得到初步確認，但可能誘發(fā)細胞因子風暴等嚴重不良反應，CAR-T細胞療法用于臨床治療HCC還需要更多的臨床研究驗證。

2.3 NK細胞

NK細胞在針對病毒感染和腫瘤的宿主先天性和適應性免疫防御中起關(guān)鍵作用，可保護肝細胞免受肝炎病毒感染或惡性轉(zhuǎn)化，在癌變早期即能迅速發(fā)揮殺瘤效應。Lin等［48］報道經(jīng)皮冷凍消融聯(lián)合同種異體NK細胞治療可顯著延長晚期HCC患者的PFS（單純消融vs.消融聯(lián)合NK-ACT：7.6個月vs.9.1個月，P=0.011）。為提高NK細胞免疫療法的特異性和殺傷效率，一些研究對NK細胞進行基因修飾，其中包括利用CAR-T細胞，將CAR過繼至NK細胞以提高其免疫效能。相較于CAR-T細胞，CAR-NK細胞因其更短的壽命而降低了自身免疫和腫瘤轉(zhuǎn)化的風險，而其釋放的IFN-γ和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等細胞因子較CAR-T治療相對安全［49］。

3 小結(jié)

免疫治療是現(xiàn)階段惡性腫瘤最具前景的治療策略，在肝癌中免疫治療已初見曙光，但目前使用的免疫療法較為單一且臨床療效有限。因此，不同免疫治療的組合，或與常規(guī)治療的聯(lián)合策略，如局部介入或消融治療后與免疫治療協(xié)同增效的模式及方法等將是未來的重點研究方向。綜上所述，肝癌的免疫治療處于快速發(fā)展階段，與肝癌相關(guān)新的TSA/TAA、免疫抑制通路等免疫靶點的發(fā)現(xiàn)和識別及對HCC免疫微環(huán)境的進一步研究，將為肝癌免疫生物治療帶來新的希望。