口蹄疫免疫抗體Elisa試驗注意事項

哈爾教·莫加西

（新疆哈密市巴里坤縣畜牧獸醫(yī)工作站 839200）

1 口蹄疫危害

口蹄疫是由口蹄疫病毒感染而誘發(fā)的以口蹄部出現(xiàn)水皰癥狀為典型特點的傳染性疾病，此病典型特點是傳播速度快，發(fā)病病程急。目前，傳染除被污染物感染后還能以氣、溶、膠的形式通過空氣長距離傳播。此病危害較大，發(fā)現(xiàn)不及時，診斷不到位將會造成慘烈局面。

2 口蹄疫診斷

考慮到口蹄疫帶來的危害，準(zhǔn)確診斷此病對及時遏制病情擴(kuò)散意義顯著。目前，效果顯著的診斷方法是通過檢測動物體液中 (主要是血清) 特異性抗體，可對FMD 病毒感染與免疫狀況做出診斷，通常采用Elisa 方法，該診斷方法也是國際貿(mào)易中指定方法。FMD 病毒抗體檢測可用于以下幾個目的：（1）診斷急性感染，用同一試驗檢測急性期和康復(fù)期豬血清樣品，血清抗體陰轉(zhuǎn)陽或抗體滴度急劇上升表示發(fā)生了感染，但診斷的前提是豬無疫苗接種史；（2）證實豬未被感染，用于國際貿(mào)易；（3）在流行病學(xué)調(diào)查中檢測感染情況；（4）支持疫病撲滅計劃和后期檢測；（5）接種疫苗后效價測定。值得提示的是，免疫豬有時抗體滴度很低，甚至檢測不到抗體，但攻毒后仍能保護(hù)[1]。

3 口蹄疫免疫抗體Elisa試驗注意事項

3.1 試劑需回溫處理

試驗過程中試劑在用之前都要經(jīng)回溫處理。尤其冬春季節(jié)，溫度較低充分回溫很重要。同時，室溫孵育期間，注意溫控、光照、通風(fēng)等，保證在恒溫狀況操作。反應(yīng)板上加樣后，務(wù)必及時加蓋封板膜，避免水分過多散失影響試驗結(jié)果。此外，孵育箱內(nèi)放置的反應(yīng)板不要疊加放置，避免受熱不均勻。

3.2 不混用不同批次試劑盒成分

為確保試劑試驗結(jié)果準(zhǔn)確，不同批次試劑盒試劑成分都要經(jīng)過優(yōu)化處理，同時要避免不同批次不同試劑成分的混合使用。

3.3 規(guī)范樣品稀釋、加樣、轉(zhuǎn)移等操作流程

加樣用樣品的稀釋，應(yīng)先加稀釋液，后加待檢血清。

加樣期間，所加物應(yīng)加注到Elisa 板孔底部，不要黏附在孔壁上。板孔內(nèi)液體輕輕搖晃，不要將液體濺出孔外，更不要產(chǎn)生氣泡，避免有弱陽性樣品顯假陰性[2]。

注意移板順序，通常是將反應(yīng)U 型板抗原抗體混合液向Elisa 板轉(zhuǎn)移。而不是將Elisa 板抗原抗體混合液向U 型板轉(zhuǎn)移。移板的目的是將U 型板抗原抗體混合液有效轉(zhuǎn)移到包被了FMD型特異性抗體的Elisa 板上繼續(xù)進(jìn)行酶促反應(yīng)。移板應(yīng)從稀釋倍數(shù)高的板孔開始，每移一次孔更換一個槍頭。

3.4 嚴(yán)格控制好溫育時間

Elisa 反應(yīng)試驗期間，一般要經(jīng)過加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后的兩抗原抗體反應(yīng)。為確保反響質(zhì)量和效果，必須要恒定一定的溫度和時間，這個過程為溫育。日常操作實踐過程中，習(xí)慣將微量板放置溫箱內(nèi)開始算升溫計時。但實際上微量板升溫到37℃就要有10min，那么實際測量的溫育時間應(yīng)推遲10min，也就是控制在70min 為宜，這樣才能確保達(dá)到預(yù)想的升溫效果。

3.5 病毒抗原放置時間不能過長

大量試驗結(jié)果證實，使用病毒抗原時間過長，反應(yīng)試驗過程中OD 值將嚴(yán)重偏低，影響OD 值的準(zhǔn)確性，會出現(xiàn)假陽性情況。為此，使用的病毒抗原務(wù)必不能超過半年以上。

3.6 Elisa底物緩沖液要做到現(xiàn)配現(xiàn)用

試驗用底物溶液，配好后為無色。使用的底物緩沖液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，因為在儲存過程中很容易長霉菌，甚至產(chǎn)生很多雜質(zhì)，干擾試驗。ABTS 底物不能暴露在強(qiáng)光下，而且對污染物非常敏感，因此，強(qiáng)烈建議顯色液現(xiàn)用現(xiàn)配。如果經(jīng)常實驗，可以考慮配制ABTS 母液，配制濃度需要參考其溶解度和稀釋、分裝方便綜合確定 （以一次試驗用完一個分裝瓶為好）。配制并分裝好后，密封，外包裹錫紙，4℃保存。注意配制過程中嚴(yán)防污染。

3.7 準(zhǔn)確把控好終止液的加入時間

在Elisa 試驗過程中，當(dāng)酶聯(lián)合反應(yīng)結(jié)果出來后，殘留酶標(biāo)液還會繼續(xù)與顯色劑反應(yīng)，此時為終止反應(yīng)，以免影響實驗結(jié)果，應(yīng)及時加入終止液。終止液的使用與底物液的加入順序一致。當(dāng)?shù)孜锓磻?yīng)時間到后應(yīng)立即加入，避免影響試驗結(jié)果。

3.8 酶標(biāo)儀讀數(shù)前要預(yù)熱0.5h

后期試驗結(jié)果測定，在酶標(biāo)儀讀數(shù)期間應(yīng)注意幾個問題：微孔板底部注意清潔衛(wèi)生，做好酶標(biāo)儀濾光片的沖洗。同時，注意預(yù)熱0.5h 后讀數(shù)，這樣能確保測量數(shù)值的準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

Elisa 法的提出大大便捷口蹄疫診斷。體現(xiàn)出來的優(yōu)點表現(xiàn)為簡單操作、靈敏度高、特異強(qiáng)；實驗穩(wěn)定性高，結(jié)果穩(wěn)定。但試驗過程中務(wù)必要做好每一環(huán)，否則會出現(xiàn)陰性、陽性及病毒液對照孔不成立等問題，影響試驗結(jié)果。