腫瘤突變負荷對肺癌免疫治療療效的預測價值

撒煥蘭 馬克威 高勇 王德強

肺癌的發(fā)病率和死亡率居全球首位，2018年全球?qū)⒂心[瘤新發(fā)病例1,810萬和腫瘤死亡病例960萬，其中肺癌占總病例數(shù)11.6%，占癌癥總死亡人數(shù)18.4%[1]。晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者1年生存率不足40%[2]，對于驅(qū)動基因陰性的晚期NSCLC患者，仍然缺乏有效的治療方法。小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）約占10%-15%，化療后進展的患者幾乎沒有更有效的治療選擇，通常預后較差。

近年來，針對程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）/配體（PD-1 ligand, PD-L1）免疫檢查點抑制劑的治療發(fā)展迅猛，開啟了晚期NSCLC治療的新篇章，但是抗PD-1/PD-L1單藥的NSCLC應答率僅為25%[3]，因此尋找合適的生物標記物（biomarker）以篩選優(yōu)勢人群，進而提高NSCLC免疫治療療效是目前肺癌免疫治療的重中之重。腫瘤突變負荷（tumor mutation burden, TMB）是近年來在多種腫瘤免疫治療中發(fā)現(xiàn)的可用于預測免疫治療療效的獨立生物標記物，高TMB表達者對免疫檢查點抑制劑治療臨床獲益更大[4]。但是對于TMB在NSCLC中的免疫療效預測價值尚存在許多爭議，因此本文對TMB在針對PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑的NSCLC免疫治療療效的預測價值進行總結(jié)。

1 免疫檢查點抑制劑的作用機制

腫瘤免疫編輯包括免疫監(jiān)視、免疫平衡和免疫逃逸三個階段，其中免疫逃逸在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著最為重要的作用。在抗腫瘤免疫反應中，T細胞介導的細胞免疫反應是最為主要的，只有初始T細胞活化后才能起到抗腫瘤效應。因此免疫治療最為重要的是解除T細胞活化的抑制信號通路。這種抑制信號通路被稱為免疫檢查點（immune checkpoints），以細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4通路）和抗PD-1及其配體PD-L1為代表。另外IDO、TIM-3、OX40、LAG-3、CD47等作為新的檢查點抑制或激活分子也逐漸被發(fā)現(xiàn)[5,6]。針對腫瘤細胞的免疫識別及免疫應答相關逃逸機制，科學家們研發(fā)出相關的腫瘤免疫治療藥物，包括抗CTLA-4單抗（Ipilimumab、Tremelimumab），通過解除T細胞活化抑制信號，從而恢復T細胞的活化及識別能力；抗PD-1/PD-L1單抗（Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab），通過促進活化T細胞的增殖，激活腫瘤抗原特異性細胞毒性T細胞的殺傷功能來增強免疫反應，從而起到殺傷腫瘤細胞的作用，而這也正是目前免疫檢查點抑制劑治療腫瘤的主要作用原理。

研究發(fā)現(xiàn)：雖然NSCLC患者CD8+T細胞存在PD-1的過表達，但CD8+T細胞卻存在PD-1高表達與免疫功能受損的雙重狀態(tài)，表現(xiàn)為細胞因子生成能力下降及和細胞增殖能力減低[7]。另一方面，在許多惡性腫瘤（包括NSCLC）中，腫瘤細胞中PD-L1高表達與腫瘤細胞的低分化和預后差有顯著的相關性[8,9]。因此，抑制PD-1通路可促進腫瘤特異性T細胞功能的恢復并減少腫瘤誘導的免疫逃逸現(xiàn)象。

2 TMB的概念

TMB是指腫瘤細胞基因組中，所評估基因的外顯子編碼區(qū)每兆堿基中發(fā)生置換和插入/缺失突變的總數(shù)。一方面驅(qū)動基因突變可以導致腫瘤的發(fā)生，另一方面大量的體細胞突變可以產(chǎn)生新抗原，這些新抗原可以激活CD8+的細胞毒性T細胞，從而發(fā)揮T細胞介導的抗腫瘤效應[10]。因此，當基因變異數(shù)目累積增多時，就會產(chǎn)生更多的新抗原，進而被免疫系統(tǒng)識別的可能性就越大。TMB最初是在使用Ipilimumab或Tremelimumab治療晚期黑色素瘤患者時作為預測療效的生物標記物[11]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擁有高水平TMB的黑素色瘤和NSCLC患者對PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑療效往往高于低水平TMB表達的患者[12]。既往研究提示：NSCLC中接受抗PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑治療的患者，與TMB密切相關的非同義突變數(shù)量與腫瘤的客觀緩解率（objective response rate, ORR）、持續(xù)臨床獲益時間及無進展生存期（progression-free survival, PFS）的改善均呈正相關[13]。

3 TMB作為生物標記物在肺癌免疫治療相關的研究進展

基于CheckMate 017[14]/057[15]兩項研究結(jié)果，PD-1抑制劑Nivolumab被美國FDA批準用于治療NSCLC鉑類為基礎化療后進展的晚期鱗癌和非鱗癌。2018年2月，Annals of Oncology雜志發(fā)表了這兩項研究3年OS數(shù)據(jù)匯總分析（隨訪40.3個月），不論是鱗癌還是非鱗癌，Nivolumab組總生存期（overall survival, OS）較多西他賽組明顯延長（HR=0.70, 95%CI: 0.61-0.81），其存在持續(xù)的生存獲益[16]。

基于CheckMate 026/227研究，今年10月NCCN發(fā)布了NSCLC指南2019年第1版，指南中指出TMB用于識別適合接受“Nivolumab+Ipilimumab”免疫聯(lián)合治療和“Nivolumab”單藥治療的肺癌患者。CheckMate 026[17]是首個用于分析TMB與PD-1抑制劑臨床獲益相關性的III期隨機對照研究，TMB高表達患者中，Nivolumab組應答率高于化療組，PFS也顯著延長，提示高TMB與免疫治療療效呈正相關。

CheckMate 227[18]是免疫聯(lián)合方案對比化療用于初治晚期或復發(fā)NSCLC的首個III期臨床研究，并且將高TMB患者的PFS作為共同主要終點進行評估。在PD-L1＜1%的患者中，TMB＜10個突變/Mb亞組中，Nivolumab聯(lián)合化療與單純化療組進行分析發(fā)現(xiàn)兩組在ORR、PFS上均無統(tǒng)計學差異；而在TMB≥10個突變/Mb亞組中，Nivolumab聯(lián)合化療組的ORR和中位無進展生存期（median PFS, mPFS）均優(yōu)于單純化療組（60.5%vs20.8%，6.2個月vs5.3個月），提示TMB未來可能成為免疫聯(lián)合化療方案中篩選優(yōu)勢人群的生物標記物。同時這項研究表明在整體人群中免疫聯(lián)合組PFS相比化療并未顯現(xiàn)優(yōu)勢（4.9個月vs5.5個月）情況下，在TMB≥10個突變/Mb組患者中，免疫聯(lián)合組PFS顯著優(yōu)于單純化療組，mPFS分別為7.2個月和5.5個月（HR=0.58,P=0.000,2）。而且在高TMB人群中，無論PD-L1表達如何，免疫聯(lián)合組PFS均優(yōu)于化療組。而在低TMB組，PFS分別為3.2個月和5.5個月，無統(tǒng)計學意義?；谝陨蠑?shù)據(jù)的公布，表明TMB可以作為生物標記物來選擇免疫治療的優(yōu)勢人群，并指出TMB≥10個突變/Mb是篩選最佳獲益人群的臨界閾值（cutoff值）。

TMB作為生物標記物在SCLC的免疫治療中仍在探索階段，SCLC與吸煙密切相關，體細胞突變負荷高，理論上產(chǎn)生的新抗原較多，是免疫治療的理想腫瘤類型[19-21]。CheckMate 032[22]研究首次將TMB用于SCLC免疫治療的療效預測，結(jié)果顯示：不論是Nivolumab+Ipilimumab還是Nivolumab單藥治療復發(fā)的高TMB小細胞肺癌患者療效均顯著增高，接受雙藥聯(lián)合治療的高TMB患者，ORR為46%，而中低TMB組分別為16%和22%。而接受nivolumab單藥治療的TMB高中低組ORR分別為21%、7%和5%。更出乎意料的是，接受兩藥聯(lián)合治療的高TMB組患者1年OS率為62.4%，而中低組分別為19.6%和23.4%，接受Nivolumab單藥的高TMB組患者1年OS率為35.2%，中低組分別為26.0%和22.1%?；诖搜芯浚琋CCN指南2017年第1版將Nivolumab±Ipilimumab作為復發(fā)SCLC二線治療的推薦方案之一。

Atezolizumab是針對PD-L1的人源化IgG1單克隆抗體，已被FDA批準用于二線及以上的晚期NSCLC治療。OAK和POPLAR系列研究[23]應用血液中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）評估血液腫瘤突變負荷（bTMB），并分析bTMB水平與Atezolizumab療效相關性。結(jié)果顯示：bTMB≥10個、≥16個和≥20個突變/Mb時均可見PFS和OS獲益，但是bTMB≥16個突變的預測水平最佳（PFS HR=0.57，OS HR=0.56），并將此數(shù)值作為OAK III期研究的cutoff值進行分析。在OAK研究中，bTMB≥16組的患者中，顯示Atezolizumab組對比化療組PFS和OS均顯著獲益（PFS HR=0.65，OS HR=0.64；mOS 13.5個月vs6.8個月），也進一步證實了bTMB≥16個突變是晚期NSCLC患者的一個可預測治療療效的有效界值。另外，如果將bTMB與腫瘤組織TMB（tTMB）進行對比，發(fā)現(xiàn)來源于同一個患者的tTMB和治療前的bTMB呈顯著正相關（rs=0.64, 95%CI:0.56-0.71），陽性率為64%（95%CI: 54-74），特異性為88%（95%CI: 83-92）。B-F1RST是首個前瞻性評估b-TMB作為Atezolizumab一線治療NSCLC療效預測標志物的臨床研究，采用bTMB≥16個突變作為該研究的cutoff值，研究顯示，高bTMB組患者無論是PFS、OS還是ORR，均較低bTMB組患者有明顯優(yōu)勢。上述結(jié)果也更進一步支持了正在進行的III期研究BFAST以bTMB作為標志物來篩選入組人群。

4 影響TMB表達的相關因素

TMB表達水平可能與多種因素有關，例如微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability, MSI-H）及某些驅(qū)動基因的存在等。Rizvi等[13]對Pembrolizumab治療晚期NSCLC患者研究時發(fā)現(xiàn)治療療效與吸煙、新抗原負荷的高表達、DNA修復通路突變（POLD1、POLE和MSH2）密切相關，同時這些因素也都與高TMB相關，因此可以通過TMB來評估治療療效。Pembrolizumab被美國FDA批準用于治療高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）或錯配修復基因缺陷（dMMR）的晚期進展患者，這也是FDA首次不以腫瘤類型而僅依據(jù)生物標記物選擇治療決策的突破。Chalmers等[24]對10萬例病例研究發(fā)現(xiàn)，在MSI-H患者中，97%患者TMB≥10個突變/Mb，83%患者≥20個突變/Mb，相反的是，只有16%高TMB患者具有MSI-H。這兩種表型的共同出現(xiàn)高度依賴于腫瘤類型，在胃腸道腫瘤中比如胃腺癌、十二指腸腺癌、小腸腺癌中，MSH-H和高TMB往往共同出現(xiàn)；而在黑素瘤、鱗狀細胞癌和肺癌中，高TMB較為常見，而MSI-H罕見。Chalmers等[24]也發(fā)現(xiàn)DNA錯配修復通路基因（MSH2,MSH6,MLH1,PMS2）、DNA聚合酶（POLE）、TOP2A和TP53BP1突變與高TMB相關。既往研究發(fā)現(xiàn)某些驅(qū)動基因可以影響PD-L1的表達，如EGFR、KRAS和ALK[25]。突變的EGFR可以上調(diào)PD-L1的表達和抑制腫瘤浸潤淋巴細胞的激活，但是擁有EGFR突變的患者比野生型患者在接受免疫治療時預后差，也許這與研究中發(fā)現(xiàn)的EGFR突變可以導致低TMB和腫瘤特異性免疫應答受損有關[26]。Coelho等[27]發(fā)現(xiàn)KRAS與TP53共同突變時往會伴隨著TMB增高。McGranahan等[28]研究發(fā)現(xiàn)約40%NSCLC存在HLA基因雜合子缺失，并且擁有HLA基因雜合子缺失的患者絕大部分擁有高TMB。

5 TMB在臨床應用的局限性

腫瘤免疫原性是腫瘤免疫啟動的基礎，繼PD-L1之后，TMB逐步成為預測免疫檢查點治療療效的潛在標志物，目前已從臨床研究逐步走向臨床應用。但是，TMB作為預測標志物還有很多不足之處：（1）TMB的檢測由于依賴基因測序，成本遠高于依靠免疫組化的PD-L1檢測；（2）不同平臺的檢測標準不統(tǒng)一；（3）年齡對TMB表達水平影響較大，并且兩者之間的關系因疾病類型的不同而有所差異[24]；（4）TMB的數(shù)量不能足以準確預測免疫療效，必須有能夠產(chǎn)生激發(fā)免疫反應的免疫性抗原的基因突變；（5）不同類型腫瘤TMB水平差異較大[24]。起初TMB的檢測是基于WES，但由于其價格昂貴限制了臨床應用，所以目前逐漸興起多基因大Panel進行檢測，但是目前多家基因檢測公司都形成了自己的TMB檢測，并且每個公司的Panel所涵蓋的基因不同，設定的cutoff值不同，所以TMB的檢測無法標準化，從而無法廣泛的應用于臨床。Chalmers等[24]發(fā)現(xiàn)TMB的高低與年齡具有明顯的相關性，10歲時中位TMB值為1.67個突變/Mb，88歲時為4.50個突變/Mb，一個符合數(shù)據(jù)的線性模型預測10歲-90歲之間的TMB差異為2.4倍。但是根據(jù)目前報道的臨床研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)療效并不與年齡呈正相關，并且有些研究數(shù)據(jù)甚至是相反結(jié)果，比如CheckMate 057和017研究，CheckMate 057中65歲-75歲亞組，免疫治療組比化療組死亡風險降低37%（HR=0.63, 95%CI:0.45-0.89），而＞75歲亞組中差異不明顯（HR=0.90,95%CI: 0.43-1.87）；CheckMate 017中65歲-75歲亞組，免疫治療組比化療組死亡風險降低49%（HR=0.51, 95%CI:0.32-0.82），而＞75歲亞組中免疫治療組比化療組死亡風險增加85%（HR=1.85, 95%CI: 0.43-1.87）[29]。由此我們可以看出，高TMB并不一定與免疫治療療效呈正相關。當然，這結(jié)果可能會受很多因素影響，其中的機制可能也比較復雜，需要我們?nèi)ジ徊教剿鳌?/p>

6 總結(jié)與展望

近年來，免疫治療為肺癌治療帶來了重大變革，從晚期二線到一線，甚至到局部晚期和早期新輔助治療研究，不論是NSCLC還是SCLC都是一路凱歌。從治療模式的選擇看，不論是免疫單藥、免疫聯(lián)合、與化療、放療、抗血管生成靶向藥物的聯(lián)合都顯示出了明顯的臨床獲益。但免疫治療目前仍有很多臨床未知，總體有效率較低，因此，還需付諸大量的努力去尋找合適的生物標記物篩選優(yōu)勢人群。目前TMB在肺癌中的預測價值已經(jīng)在多項臨床試驗中得到驗證，但也有一定程度的局限性。此外，為克服組織樣本檢測的局限性，bTMB應用逐漸廣泛，從POPLAR、OAK研究，再到B-F1RST、BFAST研究，都顯示出b-TMB預測免疫治療療效的潛力。并且首個驗證性文章在Nature Medicine雜志已發(fā)表。b-TMB是相對無創(chuàng)的檢測，外周血標本更容易獲得，異質(zhì)性更小，能夠簡便的實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測，因此這也是一個非常有前景的研究方向。此外還有更多可探索性免疫標志物，如TCR克隆性、可溶性PD-L1、血清蛋白標記、HLA表型、腸道菌群等，為克服單一生物標記物的局限性，多種聯(lián)合應用與動態(tài)監(jiān)測將會為未來臨床應用帶來更大價值。