鮮藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究進(jìn)展*

錢正明 ，李文慶 ，黃 琦 ，金李玲 ，李文佳 ，梅全喜

（1.廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司·國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，廣東 東莞 523850； 2.湘南學(xué)院，湖南 郴州 423000； 3.廣東省深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 518101）

鮮藥是指采挖后新鮮使用的中藥材，具有活性成分保留充分和藥效好的優(yōu)勢(shì)，在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久［1］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載“地黃生者尤良，此生者實(shí)為鮮品”，《傷寒論》中生姜瀉心湯以生姜入藥，《肘后備急方》用鮮青蒿治療瘧疾［2］。近年來(lái)，鮮藥在中醫(yī)藥臨床和健康保健中發(fā)揮了重要作用，如鮮石斛、鮮龍葵、鮮冬蟲夏草和鮮人參等廣泛應(yīng)用于實(shí)際生活。鮮藥研究已成為中藥科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)鮮藥應(yīng)用歷史、保鮮技術(shù)、化學(xué)成分、藥理臨床和鮮藥制劑等作了總結(jié)［3］。質(zhì)量評(píng)價(jià)研究是保障鮮藥產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步發(fā)展的關(guān)鍵，同時(shí)也是鮮藥科學(xué)研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，隨著分析技術(shù)的發(fā)展，鮮藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法也在不斷進(jìn)步，本研究中結(jié)合國(guó)內(nèi)目前鮮藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和近年來(lái)發(fā)表的鮮藥質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)和分析，為未來(lái)鮮藥的科學(xué)研究提供參考。

1 鮮藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)概況

現(xiàn)行的鮮藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要包括中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)和地方藥材標(biāo)準(zhǔn)。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》收錄鮮藥標(biāo)準(zhǔn)共7個(gè)，其中鮮藥單獨(dú)建立標(biāo)準(zhǔn)的品種有2個(gè)，即生姜［4］101和牡荊葉［4］172-173；與干品共同建立標(biāo)準(zhǔn)的品種有 5個(gè)，即鮮地黃［4］124-125、鮮蘆根［4］164、鮮石斛［4］92-93、鮮益母草［4］290-291和鮮魚腥草［4］224。其中生姜、鮮地黃藥材標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量評(píng)價(jià)項(xiàng)目比較完善，生姜包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、總灰分檢查和含量測(cè)定；鮮地黃包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、總灰分及酸不溶性灰分檢查和浸出物測(cè)定。而其他鮮藥標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量評(píng)價(jià)項(xiàng)目較少，如鮮魚腥草、鮮益母草和牡荊葉僅對(duì)藥材性狀和顯微鑒別進(jìn)行了規(guī)定，缺少檢查、含量測(cè)定項(xiàng)。

《中國(guó)藥典（一部）》收載鮮藥品種數(shù)量有限，難以滿足鮮藥臨床實(shí)際應(yīng)用的要求，為保障鮮藥的質(zhì)量，各地方根據(jù)該省用藥習(xí)慣建立了相應(yīng)的鮮藥標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)。目前，各省市中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)及中藥飲片炮制規(guī)范共收錄鮮藥80多種，其中上海市中藥飲片炮制規(guī)范中收錄最多，有 23 種，包括何首烏［5］92-94、荷葉邊［5］508、景天三七［5］311、鮮石菖蒲［5］318、鮮石斛［5］405和鮮鐵扁擔(dān)等［5］507。地方鮮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立對(duì)鮮藥的臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到了很好的保障作用。但地方鮮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究不深入、質(zhì)量評(píng)價(jià)項(xiàng)目不完善，如荷葉邊、鮮鐵扁擔(dān)只規(guī)定了來(lái)源，無(wú)檢測(cè)項(xiàng)目，何首烏、鮮石菖蒲只有性狀檢測(cè)項(xiàng)目［5］。

2 鮮藥真?zhèn)舞b別

2.1 性狀鑒別

性狀鑒別是指對(duì)藥材宏觀性狀（形狀、大小和顏色等）和感官特征（質(zhì)地、氣味和味道）進(jìn)行鑒別?！吨袊?guó)藥典（一部）》中生姜的性狀記載：“本品呈不規(guī)則塊狀，略扁，具指狀分支，長(zhǎng)4～18 cm，厚1～3 cm，表面黃褐色或灰棕色，有環(huán)節(jié)，分支頂端有莖痕或芽。質(zhì)脆，易折斷，斷面淺黃色，內(nèi)表皮環(huán)紋明顯，維管束散在。氣香特異，味辛辣。”該性狀規(guī)定藥材在形狀、大小、色澤和質(zhì)地等方面充分突出了鮮藥的特點(diǎn)：生姜較干姜體積更大，體型飽滿，略扁（干姜為扁平）；生姜斷面色為淺黃色，而干姜斷面色為黃白色或灰白色；鮮姜質(zhì)脆，易折斷，而干姜質(zhì)堅(jiān)實(shí)。冬蟲夏草鮮品相對(duì)于干品形態(tài)更飽滿，特別是子座部分多呈圓柱形，而干品子座多干癟；另外，鮮品較干品質(zhì)地稍柔韌（干品質(zhì)脆），氣味較干品淡一些［6］。

電子感官評(píng)價(jià)技術(shù)也逐漸在鮮藥性狀鑒別研究中應(yīng)用。劉紅秀等［7］采用電子鼻系統(tǒng)PEN3結(jié)合數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析法，建立了廣藿香藥材、新鮮廣藿香、薄荷藥材及新鮮薄荷4種中藥材的氣味指紋圖譜，能很好地鑒別不同類中藥材及其不同新鮮度，為鮮藥性狀鑒別提供了數(shù)字化評(píng)價(jià)方法。

2.2 顯微鑒別

顯微鑒別是利用顯微鏡對(duì)藥材的組織、細(xì)胞等微觀特征進(jìn)行分析的鑒別技術(shù)。鮮藥因新鮮狀態(tài)利于切片不易粉碎的特點(diǎn)，因此多采用切片鑒別。中國(guó)藥典中收錄的7種鮮藥中5種鮮藥材（鮮地黃、牡荊葉、鮮益母草、鮮石斛、生姜）均采用切片顯微鑒別，如鮮益母草通過(guò)其表皮細(xì)胞、下皮厚角細(xì)胞、皮層、韌皮部、木質(zhì)部、髓部、薄壁細(xì)胞的特征鑒別；生姜通過(guò)其橫切面的木栓層、皮層、中柱及薄壁組織特征鑒別。鮮藥標(biāo)準(zhǔn)中也有少部分藥材采用粉末鑒別，操作方式一般為干燥后粉碎，粉末鑒別同干品，如鮮魚腥草，藥典標(biāo)準(zhǔn)就采用了粉末鑒別，其主要粉末顯微鑒別特征為油細(xì)胞、非腺毛、腺毛、葉表皮細(xì)胞和草酸鈣簇晶。

2.3 DNA分子鑒定

DNA分子鑒別是利用藥材基因組中一段相對(duì)較短的DNA片段進(jìn)行真?zhèn)舞b定的一種分析技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是DNA分子鑒別技術(shù)的一種方法，具有快速、簡(jiǎn)便、高效等特點(diǎn)?！吨袊?guó)藥典》中烏梢蛇和川貝母標(biāo)準(zhǔn)采用該方法作為藥材鑒別方法。李文慶等［8］采用PCR技術(shù)建立了鮮冬蟲夏草的DNA分子鑒別方法，該方法基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）序列設(shè)計(jì)的特異性引物（正向 5′-AGTTACCACTCCCAAACC-3′和反向 5′-TGCTTGCTTCTTGACTGA-3′），首先通過(guò)植物基因組DNA試劑盒提取DNA；再進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng) 30 次（94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），延伸（72℃）5 min；最后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析檢測(cè)。該方法通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，可有效鑒別蝙蝠蛾擬青霉菌絲體、蛹蟲草、蟬花、亞香棒蟲草、新疆蟲草、涼山蟲草和戴氏蟲草等冬蟲夏草混淆品。

2.4 波譜鑒別

紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜和質(zhì)譜是常用的波譜技術(shù)，在中藥鑒別中均有運(yùn)用。其中，紅外光譜具有簡(jiǎn)便、快捷和特征性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，被大量應(yīng)用于中藥材的鑒別分析。有人建立了鮮冬蟲夏草紅外特征圖譜鑒別技術(shù)，將鮮冬蟲夏草干燥后粉碎，與溴化鉀粉末混合，于紅外燈下在瑪瑙乳缽中研磨均勻，壓成透明薄片，于紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)試，得其紅外光吸光圖譜，確定了7個(gè)特征峰（分別為 2926 cm-1，2855 cm-1，1746 cm-1，1652 cm-1，1546 cm-1，1084 cm-1，931 cm-1）。通過(guò)比較特征峰的方法發(fā)現(xiàn)，蟬花、蛹蟲草、中華被毛孢菌絲體、亞香棒蟲草、戴氏蟲草這5種冬蟲夏草混淆品均存在特征峰的缺失情況，該方法可有效鑒別鮮冬蟲夏草和其混淆品［9］。

2.5 薄層色譜鑒別

由于鮮藥對(duì)照藥材不易長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，薄層鑒別時(shí)多采用對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照鑒別。生姜薄層色譜鑒別，直接將生姜處理成小塊后，采用乙酸乙酯提取，以6-姜辣素作對(duì)照品，采用硅膠G薄層板，以石油醚（60～90℃）-三氯甲烷 -乙酸乙酯（2∶1∶1，V/V/V）為展開劑，以香草醛硫酸試液為顯色劑進(jìn)行鑒別。鮮冬蟲夏草薄層色譜鑒別法，將鮮品干燥粉碎，采用90%甲醇提取，以腺苷和尿苷作對(duì)照，采用4%磷酸氫二鈉溶液浸漬后的硅膠GF254薄層板，以異丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水-濃氨試液（5 ∶3 ∶1 ∶1 ∶0.1，V/V/V/V/V）為展開劑，紫外光燈（254 nm）下檢視。該方法可有效鑒別中華被毛孢菌絲體、蝙蝠蛾擬青霉菌絲體、蛹蟲草、亞香棒蟲草、新疆蟲草和涼山蟲草［8］。

2.6 特征圖譜鑒別

中藥特征圖譜鑒別技術(shù)是指藥材經(jīng)過(guò)處理后，采用色譜儀器分析，得到能體現(xiàn)藥材特征色譜峰的圖譜，并用于藥材的真?zhèn)舞b別，見(jiàn)于中國(guó)藥典品種羌活、沉香等中藥材標(biāo)準(zhǔn)，但在鮮藥材標(biāo)準(zhǔn)中尚未見(jiàn)收錄。李文慶等［8］采用高效液相色譜技術(shù)建立了鮮冬蟲夏草的特征圖譜，確定了6個(gè)特征色譜峰，通過(guò)分析40批鮮冬蟲夏草和8批蟲草混淆品，可有效鑒別中華被毛孢菌絲體、蝙蝠蛾擬青霉菌絲體、蛹蟲草、蟬花、亞香棒蟲草、新疆蟲草和涼山蟲草。同時(shí)，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立鮮冬蟲夏草蛋白類成分特征圖譜，確定鮮冬蟲夏草的6個(gè)特征蛋白峰，可有效鑒別蛹蟲草、蟬花、草石蠶、亞香棒蟲草、涼山蟲草、中華被毛孢菌絲體和蝙蝠蛾擬青霉菌絲體［10］。

氣相色譜常用于藥材揮發(fā)性成分的分析。李計(jì)萍等［11］采用水蒸氣蒸餾法得到鮮、干姜的揮發(fā)油成分，并建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法對(duì)二者成分進(jìn)行了比較。測(cè)定結(jié)果顯示，生姜檢測(cè)出77個(gè)峰，鑒定出37個(gè)成分；干姜檢測(cè)出83個(gè)峰，鑒定出44個(gè)成分，并從中尋找到了2個(gè)生姜中的特有成分，即β-欖香烯和反，反-法呢醛。采用GS-MS法對(duì)鮮冬蟲夏草中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究，鑒定出15個(gè)揮發(fā)性成分，可為冬蟲夏草鮮品的鑒別提供參考［12］。

3 鮮藥含量測(cè)定

3.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法作為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的常用檢測(cè)技術(shù)，具有操作方便、檢測(cè)速度快的特點(diǎn)，主要應(yīng)用于藥材中某一類成分的含量測(cè)定。李計(jì)萍等［13］采用紫外分光光度法比較了鮮地黃與干地黃中多糖的含量，先用80%乙醇去除小分子糖，然后用水回流提取樣品多糖，硫酸-苯酚法反應(yīng)，檢測(cè)波長(zhǎng)為480 nm，結(jié)果顯示，鮮地黃中的多糖含量（以干品計(jì)）為7.81% ～9.48%，而干地黃中的多糖含量為4.21% ～4.46%，地黃鮮品多糖含量約為干品的2倍。該結(jié)果驗(yàn)證了“地黃生者尤良”的合理性，同時(shí)也提示多糖作為地黃的重要活性成分，在鮮干地黃標(biāo)準(zhǔn)含量限度設(shè)定應(yīng)有區(qū)別。

3.2 高效液相色譜法

鮮藥所含成分復(fù)雜，分離純化難度大，高效液相色譜法具有分離能力強(qiáng)、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)，是目前鮮藥中常用的含量測(cè)定技術(shù)。劉秋瓊等［14］采用高效液相色譜法對(duì)經(jīng)保鮮處理的鮮龍葵果和干龍葵果中的抗腫瘤成分澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，經(jīng)保鮮技術(shù)處理的鮮果中澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量比干果的含量高80%以上，說(shuō)明龍葵果在干燥過(guò)程中生物堿存在流失。王夢(mèng)溪等［15］采用高效液相色譜法測(cè)定益母草鮮品和干品中生物堿和黃酮類成分含量，結(jié)果顯示，鮮品中生物堿（水蘇堿和益母草堿）和黃酮（槲皮素和芫花素）的含量均明顯高于干品，說(shuō)明干燥過(guò)程會(huì)引起益母草生物堿及部分黃酮類成分的損失。李文慶等［16］采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)建立了冬蟲夏草中3種甾醇類成分（麥角甾醇、膽甾醇和谷甾醇）的測(cè)定方法，并對(duì)冬蟲夏草干品和鮮品進(jìn)行比較，結(jié)果鮮冬蟲夏草繁育品與干冬蟲夏草繁育品甾醇含量相當(dāng)，提示干冬蟲夏草采用低溫冷凍干燥技術(shù)很好地保留了鮮冬蟲夏草中原有甾醇類成分。

3.3 氣相色譜法

氣相色譜技術(shù)多用于藥材中揮發(fā)性成分的定量分析。何剛等［17］采用GC-MS法建立了鮮魚腥草中4種揮發(fā)油類成分（4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮）的定量方法，結(jié)果顯示，采收期不同，魚腥草鮮藥材揮發(fā)油中4種揮發(fā)性成分的含量差異較大。其次，生代謝產(chǎn)物的積累隨時(shí)間推移，4種成分含量呈上升趨勢(shì)，到8月中旬含量最高，此后含量下降。

4 鮮藥有害物質(zhì)測(cè)定

有害物質(zhì)測(cè)定是鮮藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要組成部分，目前，鮮藥質(zhì)量主要涉及的有害物質(zhì)包括重金屬和農(nóng)藥殘留。

重金屬常見(jiàn)測(cè)定技術(shù)包括比色法、原子吸收光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法等，前者的使用越來(lái)越少，后兩者已成為主流技術(shù)。張建強(qiáng)等［18］采用原子吸收光譜技術(shù)建立了紫皮石斛中5種重金屬元素（鉻、鎘、鉛、汞和銅）的測(cè)定方法，結(jié)果顯示，根和莖中均檢測(cè)到了鉻、汞、銅，未檢測(cè)到鎘、鉛。楊健等［19］采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜技術(shù)建立了鮮地黃中砷、汞、鉛和鎘的測(cè)定方法，測(cè)定結(jié)果表明，11個(gè)不同產(chǎn)地的鮮地黃中鉛、砷和鎘殘留均符合國(guó)家《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，而汞殘留超標(biāo)。錢正明等［20］采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法建立了一種同時(shí)測(cè)定鮮冬蟲夏草樣品中鉛、鎘、砷、汞、銅5種重金屬殘留量的分析方法，并對(duì)15批鮮冬蟲夏草樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，15批樣品5種重金屬殘留均符合中國(guó)、美國(guó)和歐洲的藥典標(biāo)準(zhǔn)要求。

農(nóng)藥殘留也會(huì)影響鮮藥品質(zhì)。盛振華等［21］采用在線凝膠色譜-氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了鮮浙貝母藥材中敵敵畏、樂(lè)果、脫葉磷等17種農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法，并對(duì)市場(chǎng)上收集的3批鮮藥樣品進(jìn)行了分析，其中二苯砜的平均含量為0.214 mg/kg，咯菌腈的平均含量為0.112 mg/kg，其余農(nóng)藥均未檢出。該方法簡(jiǎn)便、快速和靈敏，可滿足鮮貝母中多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測(cè)。

5 鮮藥生物活性評(píng)價(jià)

鮮藥生物活性檢測(cè)技術(shù)是以鮮藥的生物反應(yīng)活性為基礎(chǔ)，采用特定試驗(yàn)測(cè)定鮮藥生物活性，從而對(duì)鮮藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)［22］。錢正明等［6］以超氧化物歧化酶（SOD）活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)分析鮮冬蟲夏草及不同干燥條件下的干品，結(jié)果顯示，鮮冬蟲夏草SOD酶活力最好，凍干冬蟲夏草、陰干冬蟲夏草和烘干冬蟲夏草的SOD酶活力依次減少，其中烘干冬蟲夏草樣品的SOD酶活力僅為鮮品的1/3。相較于干燥藥材，鮮藥細(xì)胞內(nèi)的生物活性分子保存較好，是鮮藥材相對(duì)干品在藥效上的優(yōu)勢(shì)之一。因此，在鮮藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中引入生物活性檢測(cè)技術(shù)將有助于鮮藥質(zhì)量的全面評(píng)價(jià)。

6 小結(jié)

鮮藥為中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，大量應(yīng)用于疾病治療和健康養(yǎng)生領(lǐng)域。目前，鮮藥標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量有限，難以滿足大量實(shí)際應(yīng)用鮮藥品種的需求，未來(lái)需針對(duì)鮮藥的實(shí)際使用品種情況制訂相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以規(guī)范鮮藥的質(zhì)量，保障產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展?，F(xiàn)行鮮藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，部分品種存在研究不深入、檢測(cè)項(xiàng)目不完善的情況，如荷葉邊和鮮鐵扁擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了藥材來(lái)源，未有任何其他檢測(cè)項(xiàng)目。中藥鮮品在化學(xué)成分和藥理藥性等方面與干品會(huì)有所不同，干品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不一定適用于鮮藥。建議加強(qiáng)中藥鮮品與干品的比較研究，找出其共同點(diǎn)及差異點(diǎn)，建立鮮藥特色質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并納入鮮藥質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。