基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析羚羊角散治療子癇的作用機(jī)制*

姜 洋 劉松君 李 超

1 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 浙江 杭州 310016

子癇是妊娠期高血壓的嚴(yán)重階段，可能導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育遲緩、早產(chǎn)、缺氧，甚至死亡，也可能導(dǎo)致孕婦胎盤早剝及彌漫性血管內(nèi)凝血[1］。及早發(fā)現(xiàn)并積極處理輕度子癇前期可改善患者癥狀，阻止病情進(jìn)展至重度子癇前期和子癇階段，改善妊娠結(jié)局。中醫(yī)藥治療先兆子癇具有特定優(yōu)勢[2-3］。羚羊角散（羚羊角、獨(dú)活、防風(fēng)、當(dāng)歸、川芎、茯神、酸棗仁、薏苡仁、木香、甘草、杏仁）出自《濟(jì)生方》，具有平肝息風(fēng)、養(yǎng)血安神之功效，主治妊娠子癇。臨床常用于治療妊娠高血壓綜合征等屬于肝旺生風(fēng)證者。

羚羊角散作為經(jīng)典名方在臨床上具有確切的療效，但其確切的作用機(jī)理尚不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)S100P蛋白促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增生及侵襲遷移能力，提示S100P可能在妊娠子癇的發(fā)生中具有一定作用。本研究將通過對多數(shù)據(jù)源整合，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘羚羊角散具體的作用靶點(diǎn)及可能的藥物作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 多源信息融合獲取子癇相關(guān)基因：信息源1來自NCBI基因數(shù)據(jù)庫：以eclampsia檢索NCBI基因數(shù)據(jù)庫，檢索得到334個(gè)與子癇相關(guān)的基因；信息源2來自臨床治療子癇藥物：用于治療子癇的首選藥物是硫酸鎂，硫酸鎂共作用于6個(gè)靶基因；共計(jì)340個(gè)基因。

1.2 采用DAVID工具對子癇相關(guān)通路進(jìn)行分析：KEGG

數(shù)據(jù)庫是一個(gè)聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識(shí)庫，其子數(shù)據(jù)庫PATHWAY匯集了分子交互作用及其反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)人工通路圖[4］。DAVID是一個(gè)在線功能注釋系統(tǒng)，包括：基因功能注釋、通路注釋等。網(wǎng)址為http：//david.abcc.ncifcrf.gov/。利用該工具分析通路可以直觀觀測到查詢基因所富集的通路信息、富集通路所含的基因及相應(yīng)的蛋白信息，若分析和某一疾病相關(guān)的重要通路，則可根據(jù)閾值(P＜0.05)確定重要的通路來進(jìn)行重點(diǎn)分析，有助于了解疾病的分子基礎(chǔ)，并為新藥研發(fā)提供可借鑒的思路。

1.3 羚羊角散治療子癇疾病“藥物分子-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：基于關(guān)聯(lián)規(guī)則，采用軟件BATMAN-TCM[5］在線分析工具預(yù)測羚羊角散的作用靶點(diǎn)，通過挖掘組分間關(guān)系，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，深化對子癇疾病與組分配伍的規(guī)律認(rèn)識(shí)。

2 結(jié)果

2.1 子癇相關(guān)基因通路富集分析：340個(gè)子癇相關(guān)基因共有230個(gè)基因富集到85條通路中。富集程度排名前十的通路分別為Pathways in cancer、Cytokine-cytokine receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、Herpes simplex infection、HIF-1 signaling pathway、Rheumatoid arthritis、MicroRNAs in cancer、Chagasdisease(Americantrypanosomiasis)、Tuberculosis、Proteoglycans in cancer。

基因在各通路中出現(xiàn)頻率越高，表明其參與該疾病的可能性越強(qiáng)。在以上顯著富集的10條通路中出現(xiàn)頻次達(dá)7次的有基因ID：3569（gene name：IL-6）、出現(xiàn)頻次6次的有356（FasL）、出現(xiàn)頻次5次的有1387（CREBBP）、1956（EGFR）、2033（EP300）、3458（IFNG）、3459（IFNGR1）、3460（IFNGR2）、355（FAS）、7040（TGFB1）、7097（TLR2）、7099（TLR4）、7124（TNF）、7422（VEGFA）。上述在顯著富集通路中高頻出現(xiàn)的靶基因可能和子癇的發(fā)生存在緊密的聯(lián)系。

2.2 羚羊角散復(fù)方中小分子化合物作用靶點(diǎn)分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：羚羊角散由11味中藥共包含766個(gè)單體化合物，其中233個(gè)化合物在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫無結(jié)構(gòu)信息，靶蛋白無法預(yù)測。其余533個(gè)化合物中有18個(gè)化合物作用靶點(diǎn)為S100家族。可見S100蛋白家族為羚羊角散復(fù)方的重要靶點(diǎn)群。同時(shí)羚羊角散復(fù)方388個(gè)靶基因顯著富集在46個(gè)通路中，在46個(gè)通路中出現(xiàn)頻率達(dá)10次以上的基因有9個(gè)，包括ITPR1、ITPR3、ITPR2、CACNA1C、CACNA1D、CALM1、CALM2、CALM3、CACNA1S。在上述9個(gè)基因上開發(fā)的藥物多數(shù)為鈣通道阻滯藥物及神經(jīng)系統(tǒng)藥物，如氯維地平、咖啡堿。表明羚羊角散具有和西藥氯維地平、咖啡堿類似的效果，能降壓和鎮(zhèn)靜。

羚羊角散治療子癇疾病“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建包含全部533個(gè)化合物、作用的靶蛋白、疾病和信號通路。藥靶網(wǎng)絡(luò)顯示，最少有20種化合物作用于該靶點(diǎn)。OMIM疾病數(shù)據(jù)庫顯示主要和疼痛相關(guān)。

2.3 治療妊娠子癇首選藥物硫酸鎂藥物靶點(diǎn)分析：目前，用于治療子癇的首選藥物是硫酸鎂（Drugbank數(shù)據(jù)庫ID：DB00653）。其共作用于6個(gè)靶蛋白，分別為CCG1_HUMAN（gene ID：786）、CA2D1_HUMAN（781）、CAC1C_HUMAN（775）、CACB1_HUMAN（782）、CACB2_HUMAN（783）、CAC1S_HUMAN（779）。在該6個(gè)靶蛋白上共開發(fā)了26種藥物，26種藥物為鈣離子通道阻滯劑或利尿劑，其用途主要為降血壓及預(yù)防心絞痛。該26種藥物共作用于163個(gè)基因。其中VCAM1_HUMAN（7412）、S29A2_HUMAN（3177）、S29A1_HUMAN（2030）、S100B_HUMAN（6285）、C11B2_HUMAN（1585）、ADA1D_HUMAN（146）6個(gè)基因包含在子癇340個(gè)相關(guān)基因中。說明硫酸鎂治療子癇不僅是單作用于已知的6個(gè)基因，上述的6個(gè)靶基因也可能為硫酸鎂的潛在作用靶點(diǎn)。經(jīng)KEGG通路數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，163個(gè)基因主要富集在Neuroactive ligand-receptor interaction、Nicotine addiction、Calcium signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、Retrograde endocannabinoid signaling、Morphine addiction、Serotonergic synapse、cAMP signaling pathway、MAPK signaling pathway等信號通路中。其中鈣離子信號通路和MAPK信號通路也同時(shí)為羚羊角散靶基因顯著富集的通路，表明這兩個(gè)通路可能為子癇發(fā)生發(fā)展重要的靶通路[6-7］。

2.4 作用于S100P蛋白的藥物及靶點(diǎn)分析：目前Drug-Bank數(shù)據(jù)庫中作用于S100P蛋白的藥物只有Cromoglicic acid(色甘酸)一種，其作用靶點(diǎn)為KCMA1_HUMAN（KCNMA1）和S100P_HUMAN（S100P）。同種藥物作用于不同靶蛋白，說明該多個(gè)靶蛋白靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)相似。所以，以下作用于KCNMA1的藥物，也可能作用于S100P。作用于KCNMA1的藥物共9種，屬于利尿降壓藥、麻醉鎮(zhèn)痛藥、抗過敏藥和抗真菌藥。上述藥物中有7種其對應(yīng)的適應(yīng)癥與硫酸鎂具有較高相似性，我們推測S100P可能為子癇用藥的重要潛在靶點(diǎn)。檢索基因數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)同S100P存在相互作用的基因共有21個(gè)，包括TERF2IP、AGER、IL-11、S100B、TFIP11、S100A1、S100A2、S100A4、S100Z、PSMD4、PPM1G、NUSAP1、LRRC45、KRAS、CDH1、CCDC103、EZR、SUGT1、BAG3、ESR2、IGBP1。S100P除了同S100家族的其它5個(gè)基因存在互作外，還同白介素受體IL-11以及AGER存在相互作用。而在子癇相關(guān)基因顯著富集的通路中，白介素相關(guān)受體IL-6出現(xiàn)頻率為最高。有研究表明孕晚期IL-6升高和維生素D缺乏導(dǎo)致子癇前期發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8］。

上述研究說明S100蛋白家族成員和子癇發(fā)生存在較強(qiáng)關(guān)聯(lián)，無論中藥羚羊角散還是西藥硫酸鎂，S100蛋白家族成員均為其重要靶點(diǎn)群。鈣離子信號通路和MAPK信號通路可能為子癇發(fā)生發(fā)展的重要靶通路。我們猜測，S100P可能通過（相互作用）調(diào)控白介素或S100蛋白家族相關(guān)受體，促使其表達(dá)水平升高進(jìn)而導(dǎo)致子癇。

3 討論

中藥復(fù)方的臨床療效是其多個(gè)活性成分交互作用的綜合體現(xiàn)，而不是單一化學(xué)成分的單獨(dú)作用。因此，本研究對已上市一線藥物靶點(diǎn)進(jìn)行解析，同時(shí)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選羚羊角散核心靶點(diǎn)及靶通路。基于二者共同的藥物靶點(diǎn)及潛在信號通路，分析得出白介素受體、S100蛋白家族靶蛋白為核心靶點(diǎn)，化合物其作用的潛在信號通路為鈣離子信號通路、MAPK信號通路和子癇發(fā)生密切相關(guān)，也是決定羚羊角散臨床療效的關(guān)鍵。本研究結(jié)果為中醫(yī)藥治療子癇的藥物作用機(jī)制研究提供新的思路。