酶聯免疫斑點法在重癥藥疹致敏藥物鑒定中的應用

高雪梅 章星琪 王芳

中山大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，廣州510080

藥疹是藥物通過注射、內服、吸入等途徑進入人體后引起的皮膚黏膜急性炎癥反應。重癥藥疹是一類病情危重的藥疹的統稱，主要包括Stevens-Johnson 綜合征/中毒性表皮壞死松解癥（SJS/TEN）、剝脫性皮炎型藥疹、伴嗜酸性粒細胞增多和系統癥狀的藥物反應（drug reaction with eosinophilia and systemic symptoms，DRESS）、急性泛發(fā)性發(fā)疹性膿皰?。╝cute generalized exanthematous pustulosis，AGEP）。重癥藥疹除皮損泛發(fā)之外，常伴有發(fā)熱等全身中毒癥狀及多臟器損害，病死率可高達40%[1]。對于重癥藥疹的診治和預防，明確致敏藥物并及時停用和避免再次暴露是關鍵。

目前對于臨床工作中遇到的藥疹病例，臨床醫(yī)生主要依靠病史和藥疹潛伏期判斷致敏藥物，而在患者同時服用多種藥物且病史回憶欠準確的情況下，傳統的判斷方法往往有失準確。致敏藥物的實驗室鑒定方法分為體內試驗和體外實驗，其中，體內試驗包括皮內試驗、斑貼試驗和藥物激發(fā)試驗；體外實驗包括嗜堿性粒細胞脫顆粒實驗、淋巴細胞轉化實驗（lymphocyte transformation test，LTT）、藥物誘導細胞因子釋放實驗如酶聯免疫斑點法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）等[2]。對于重癥藥疹，體內試驗有再次誘發(fā)疾病的可能性，因此較難開展；在體外實驗中，與LTT相比，ELISPOT是新的實驗方法，具有較高的靈敏度和特異度，近年已有不少利用ELISPOT 鑒定重癥藥疹致敏藥物的報道，我們就ELISPOT 在重癥藥疹致敏藥物鑒定中的應用做一綜述。

一、重癥藥疹發(fā)病機制及ELISPOT檢測原理

目前研究證實，重癥藥疹的主要發(fā)病機制為T 細胞介導的遲發(fā)型超敏反應[3]。藥物抗原初次進入機體后，可通過以下四種方式完成抗原提呈過程：①經典的抗原提呈過程；②結合抗原提呈細胞表面的主要組織相容性復合體分子；③結合特定人類白細胞抗原（HLA）后被抗原提呈細胞識別；④直接非共價結合T細胞受體[4]。抗原提呈的最終結果是效應T 細胞被活化，并形成藥物特異性記憶T 細胞[3]，該記憶T細胞可在機體內存活十余年[5]，當機體再次暴露于相同的藥物抗原，記憶T細胞可迅速活化，通過分泌大量細胞因子如干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、趨化因子配體9（CXC chemokine ligand 9，CXCL9）、CXCL10、白細胞介素4（IL-4）和IL-5以及細胞毒性蛋白如顆粒溶素、穿孔素等[1，6]，引發(fā)嚴重的免疫反應，臨床則表現為皮膚黏膜紅腫、水皰、壞死剝脫，甚至內臟器官損傷。

1980年代，Czerkinsky 等[7]首次提出 ELISPOT，它通過在體外檢測單細胞分泌的細胞因子來判斷被檢測細胞是否活化。因為藥物特異性記憶T細胞可在重癥藥疹患者體內長期存活，所以可分離患者的外周血T細胞，在體外用可疑藥物進行刺激，如果加入的是致敏藥物，則T細胞會被活化并分泌細胞因子，利用ELISPOT 技術檢測細胞因子可判斷T細胞是否活化，進而確定致敏藥物。具體過程是：在聚偏二氟乙烯為基質的培養(yǎng)板上，預先包被特異性抗體，加入藥疹患者的外周血單個核細胞和可疑藥物或其衍生物共同孵育，在藥物抗原的刺激下藥物特異性T 細胞能分泌多種細胞因子，后者可被膜上的特異性抗體捕獲，經標記顯色，在孔底部形成點狀聚集，根據形成的斑點數來判定結果。與LTT 相比，ELISPOT 能夠檢測單個細胞分泌的細胞因子，從而大大增加檢測敏感度。

二、ELISPOT在重癥藥疹的應用

SJS/TEN 中效應性T 細胞和自然殺傷細胞分泌的炎癥因子主要有穿孔素/顆粒酶B（GrB）、顆粒溶素、IFN-γ、TNF-α 等[8]，因此，以往學者在 SJS/TEN 患者中應用ELISPOT 時，主要檢測的細胞因子為 IFN-γ、IL-4 和 GrB。Polak 等[9]選擇 9 例 SJS/TEN 患者分別運用 ELISPOT 法及LTT法進行致敏藥物鑒定，結果顯示7例IFN-γ ELISPOT 陽性，4 例 IL-4 ELISPOT 陽性，5 例 LTT 陽性，可見，IFN-γ ELISPOT 的敏感度比 LTT 高。Haw 等[10]也比較了 LTT 與ELISPOT 篩選SJS/TEN 患兒致敏藥物的敏感度，發(fā)現4 例SJS/TEN 患兒 IFN-γ ELISPOT 全部陽性，1 例 IL-4 ELISPOT陽性，2 例 LTT 陽性。Klaewsongkram 等[11]對 11 例別嘌醇致SJS/TEN的確診病例通過IFN-γ ELISPOT確定致敏藥物，結果顯示IFN-γ ELISPOT敏感度為73%。以上結果表明，在運用 ELISPOT 對 SJS/TEN 進行致敏藥物檢測時，IFN-γ 較 IL-4更為合適，這也和SJS/TEN的發(fā)病機制相一致[9]。也有研究者通過 ELISPOT 測定 GrB 篩選致敏藥物。Porebski 等[12]應用不同方法對15 例SJS/TEN 確診病例進行致敏藥物鑒定，結果顯示GrB ELISPOT 的敏感度為33%，特異度為98%，而采用流式微珠陣列技術檢測IFN-γ的敏感度為55%，通過流式細胞儀檢測CD4+T 細胞分泌的顆粒溶素的敏感度為53%，3 種方法聯合檢測的敏感度可達80%，而LTT 的敏感度僅為27%。

既往文獻顯示，顆粒溶素是SJS/TEN 中導致角質形成細胞凋亡的關鍵介質，它與疾病的嚴重程度呈正相關[13-14]；研究顯示，SJS/TEN 患者外周血中IFN-γ 誘導的趨化因子CXCL9 和 CXCL10 均升高[6]，SJS/TEN 患者外周血和水皰皰液中 TNF-α 異常升高[15]。因此，筆者認為顆粒溶素、CXCL9、CXCL10和TNF-α均有潛力成為用ELISPOT判斷致敏藥物的檢測指標。同時，應用ELISPOT 聯合檢測多種細胞因子或細胞毒性蛋白，極有可能進一步提高檢測敏感度。

除 SJS/TEN 外，研究者還將 ELISPOT 應用于 DRESS 患者 。Klaewsongkram 等[11]對 13 例明確由別嘌醇致敏的DRESS 患者通過IFN-γ ELISPOT 確定致敏藥物，結果顯示IFN-γ ELISPOT 敏感度為 69%。Polak 等[9]應用 ELISPOT 和LTT 法對7 例DRESS 患者進行致敏藥物鑒定，IFN-γ ELISPOT 5例陽性，IL-4 ELISPOT 4例陽性，而LTT法1例陽性。Haw 等[10]應用 LTT 法、IFN-γ ELISPOT 和 IL-4 ELISPOT對5 例DRESS 患兒篩選致敏藥物，結果顯示2 例IFN-γ ELISPOT陽性，而5例IL-4 ELISPOT陽性，2例LTT陽性。由此可見，對DRESS致敏藥物的檢測，ELISPOT敏感度也高于LTT。有趣的是，與SJS/TEN 不同，對DRESS 患者應用IL-4 ELISPOT篩選致敏藥物敏感度比IFN-γ ELISPOT高，可能與DRESS 患者中Th2 型細胞因子（包括IL-4、IL-5）占優(yōu)勢有關[5，16]。

值得注意的是，獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）患者在抗病毒治療過程中出現重癥藥疹并不少見，攜帶HLAB*57：01 基因與抗病毒藥阿巴卡韋致藥疹有關，但HLAB*57：01 基因的陽性預測值只有 55%[17]。雖然 HIV 病毒感染使機體免疫功能部分或完全喪失，致敏T 淋巴細胞只產生少量細胞因子，但ELISPOT 法仍能有效鑒定出此類患者的致敏藥物。Esser 等[18]對接受阿巴卡韋治療的HIV 患者進行研究，其中5 例為HLA-B*57：01 陽性并明確為阿巴卡韋致敏患者，12例為HLA-B*57：01陰性的可疑阿巴卡韋致敏患者，結果顯示5 例HLA-B*57：01 陽性患者IFN-γ ELISPOT 全部陽性；而 12 例 HLA-B*5701 陰性患者中 5 例IFN-γ ELISPOT陽性。雖然缺乏與其他實驗方法的對照，該研究仍然提示，應用ELISPOT法鑒定AIDS患者的致敏藥物具有可行性，若能同時聯合基因檢測，則有可能進一步提高陽性預測值。

三、ELISPOT的影響因素

1.試驗時機的選擇：既往研究者普遍認為體外實驗如LTT 應選擇在疾病的恢復期進行，而ELISPOT 的應用時機較為靈活，可在重癥藥疹病程早期進行[1]。Polak 等[9]研究表明，遲發(fā)型藥物超敏反應患者在疾病的急性期進行ELISPOT陽性率較高。Haw等[10]應用ELISPOT對16名藥疹患兒進行致敏藥物鑒定，共收集不同患兒的7份急性期（發(fā)病30 d內，平均發(fā)病時間6 d）和7份恢復期（平均發(fā)病時間185 d）血標本，另外選取2名患兒分別收集急性期與恢復期的血標本，發(fā)現應用ELISPOT 檢測藥物特異性T 細胞分泌的細胞因子尤其是IL-4 的敏感度在急性期（IL-4 ELISPOT 100%，IFN-γ ELISPOT 88.9%）比恢復期（均為66.7%）高。因此，為了提高敏感度，在重癥藥疹發(fā)病30 d 內進行ELISPOT較為適宜。

2.受試藥物：ELISPOT 實驗結果與藥物致敏原的選擇以及藥物濃度有關。在體外實驗中，由于無法模擬藥物體內代謝過程，難以形成完全抗原激活T細胞，因此可能無法得到陽性結果。目前關于遲發(fā)型超敏反應介導藥疹的抗原提呈機制在不斷發(fā)展，有些藥物如卡馬西平，可直接激活T細胞[4]，這一不依賴完全抗原的T細胞激活過程可能預示著ELISPOT將有更廣泛的應用空間。

如何選擇ELISPOT 中的藥物濃度尚沒有統一的結論，設定原則是根據患者的治療濃度、藥代動力學綜合推算，同時設置從低濃度開始的至少3個濃度梯度。有研究者觀察1 名萬古霉素致敏的藥疹患者在不同藥物濃度下IFN-γ ELISPOT 反應情況，結果顯示低濃度時，IFN-γ ELISPOT 陰性，隨著濃度增加，IFN-γ ELISPOT 陽性反應增強[9]。這提示受試藥物濃度過低易導致假陰性，所以設置不同的藥物濃度梯度極為重要。

3.T淋巴細胞的功能：對于合并免疫缺陷疾病或使用免疫抑制劑的患者，T細胞的活化增殖會受到抑制。為解決這一問題，有學者在ELISPOT 中引入程序性死亡配體L1（programmed death-ligand 1，PD-L1）抑制劑。PD-L1 和其受體程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）的結合能抑制T淋巴細胞增殖和細胞因子分泌，而PD-L1抑制劑可促進活化的藥物特異性 T 細胞分泌 IFN-γ[19]，進而提高ELISPOT 的敏感度。Klaewsongkram 等[11]對 26 例明確由別嘌醇導致的重癥藥疹（DRESS、SJS/TEN）患者用IFN-γ ELISPOT 檢測致敏藥物：用不同濃度（10、100 mg/L）的別嘌醇及其活性代謝產物氧別嘌醇進行刺激，并設置加入或不加入PD-L1抑制劑的T細胞孵育環(huán)境，結果顯示加入PD-L1抑制劑且氧別嘌醇濃度為100 mg/L 組IFN-γ ELISPOT 陽性率最高，總體敏感度為79.2%，特異度為95.2%。也有研究者在IFN-γ ELISPOT 基礎上，預先采用CD3/CD28抗體與患者的外周血單個核細胞共孵育7 d，結果顯示經過抗體孵育后 IFN-γ ELISPOT 法陽性率明顯高于單純IFN-γ ELISPOT和LTT[20]。這些結果提示，可以通過改善T細胞的活化狀態(tài)和孵育環(huán)境提高ELISPOT檢測致敏藥物的敏感度。

四、與其他免疫學方法的比較

在體內試驗中，斑貼試驗安全易行，其陽性反應與藥疹類型有關，在某些類型藥疹如DRESS、急性泛發(fā)性發(fā)疹性膿皰病患者有較高的敏感度，而在SJS/TEN 患者敏感度為9%～24%[21-23]。藥物激發(fā)試驗是尋找致敏藥物的金標準，但可誘發(fā)嚴重不良反應，具有一定危險性，因而不適用于重癥藥疹[24]。

體外實驗中，LTT 的敏感度在遲發(fā)型超敏反應介導的藥疹達 60% ～ 70%[25]；在重癥藥疹 LTT 敏感度為 14% ～73%，特異度82% ～ 100%[9-10，12，26]，因該試驗有放射性，結果受多因素影響，不能早期鑒定致敏藥物，所以其在臨床中的應用受限。而ELISPOT在重癥藥疹致敏藥物鑒定中的總體敏感度為 25% ～ 100%，特異度 95% ～ 98%[9-12，18，20]；在 SJS/TEN 中 IFN-γ ELISPOT 和 IL-4 ELISPOT 的敏感度分別為73% ～ 100%、25% ～ 50%；而對于DRESS，IFN-γ ELISPOT敏感度為40%～100%，IL-4 ELISPOT 敏感度80%～100%，ELISPOT 聯合皮內試驗敏感度 79%，特異度 100%[27]。因此，不難看出，ELISPOT在重癥藥疹致敏藥物鑒定中敏感度高于LTT。

綜上所述，ELISPOT在重癥藥疹尤其是SJS/TEN致敏藥物的鑒定中具有敏感度高和特異度高的優(yōu)勢，但由于目前此項方法的研究較多集中于SJS/TEN 和DRESS，能否應用于其他更常見的藥疹類型尚待進一步研究。相信隨著技術的改進和發(fā)展，ELISPOT 將成為臨床醫(yī)生判斷藥疹患者致敏藥物的可靠工具。