豬圓環(huán)病毒不同基因型毒株間在自然條件下發(fā)生基因重組的研究進(jìn)展

丁鵬 王志全 范懿娜

(1，山東省青島西海岸新區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 266400；2，山東省青島西海岸新區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 266400)

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV）為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬（Circovirus genus）成員，病毒粒子直徑為17nm，呈二十面體對稱，為圓形小顆粒狀，是目前已知最小的動物病毒之一[1-2]。根據(jù)病毒的基因組和血清學(xué)特征分為2 個型：PCV1 和PCV2。PCV1 為PK15 細(xì)胞系的一種污染物，對豬無致病性，因此，有關(guān)PCV1 的研究較少，而PCV2 對豬有致病性，能引起以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 （Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）為主要特征的一系列疾病。PMWS于1997 年首次在加拿大證實，自2004 年以來，世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)相繼出現(xiàn)豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病（Porcine circovirus associated disease，PCVAD) 的爆發(fā)[3-4]，該次大規(guī)模流行以高覆蓋率、高發(fā)病率和高致死率為特征，危害相當(dāng)嚴(yán)重，給世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，近年來成為世界范圍的研究熱點(diǎn)。PCV1 與PCV2 具有相似的基因組構(gòu)成，兩者基因組相似性約為70%。病毒基因組由單股負(fù)鏈閉環(huán)狀DNA 組成，PCV1 含1758 核苷酸（nt），PCV2 由1766～1768nt 組成。這兩種病毒包含3 個主要閱讀框（ORFs）構(gòu)成，其中ORF1 編碼蛋白與病毒復(fù)制酶有關(guān)；ORF2 編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒保護(hù)性抗原主要成分；ORF3 編碼蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能，并與病毒在機(jī)體內(nèi)的致病性有關(guān)[5-6]。國際上將PCV2 統(tǒng)一規(guī)范命名，分為PCV2a、PCV2b 和PCV2c 三個基因型[7-8]。自2000年，有關(guān)PCV2 遺傳變異的報道增多[9-10]，相對PCV2 自然重組變異的報道較少。近來，PCV 重組作為其分子遺傳變異的又一重要領(lǐng)域，涉及該病毒的自然重組變異機(jī)制、自然重組對其致病性及免疫原性的影響。本文歸納了近年來有關(guān)PCV 自然重組模式的研究進(jìn)展，旨在為今后該病毒的重組機(jī)制及致病性研究提供借鑒。

1 PCV2 同種基因型間的重組

目前，在世界范圍內(nèi)豬群中流行的主要以PCV2a 和PCV2b兩種基因型，以PCV2a 為主要基因型向PCV2b 為主要基因型轉(zhuǎn)型的趨勢。通過對國內(nèi)不同地區(qū)送檢的病料樣品進(jìn)行檢測和PCV2 基因組序列分析，新發(fā)現(xiàn)了2 個可疑的重組序列09GS（HQ395028）和HN0907 （GU938303），這2 個重組序列為09CQ （HQ395024）和Zhuji 2003 （AY579893）兩個親本毒自然重組導(dǎo)致的。全基因序列分析，該2 個親本毒均為PCV2b 基因型，通過不同的重組模式進(jìn)行，重組交換位點(diǎn)分別位于ORF1 和ORF2[11]，研究表明，自然重組引起PCV2 遺傳變異的多樣性。此外，歐洲學(xué)者從臨床PMWS 病例分離到一株P(guān)CV2b重組毒株，重組位點(diǎn)分別位于762～871nt 和1335～1372nt[12]，其中762～871nt 位點(diǎn)臨近已報道的重組位點(diǎn) （716～751nt 和963nt），而1335～1372nt 位點(diǎn)為首次報道。該位點(diǎn)位于ORF2內(nèi)，與已報道的重組位點(diǎn)不同（1057～1167 和1712～1727）[13]。該研究表明，重組毒株與親本毒株相比具有較好的體外繁殖特性，預(yù)示著PCV2b 間重組將導(dǎo)致臨床PCV2 新基因亞型的出現(xiàn)。據(jù)香港學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，有3 個來自香港的PCV2 重組序列，經(jīng)預(yù)測重組位點(diǎn)位于PCV2 復(fù)制原點(diǎn)和復(fù)制酶基因，還證實GenBank 中來自中國大陸的PCV2 序列也存在自然重組現(xiàn)象，與香港報道的重組模式相似[14]。

2 PCV2 不同基因型間的重組

對PCV2 流行毒株的遺傳變異分析表明，豬群中流行的PCV2a 和PCV2b 毒株存在共感染現(xiàn)象，這為不同基因型間在感染豬體內(nèi)發(fā)生自然重組提供先決條件。來自韓國報道，對2005～2007 年間擴(kuò)增的PCV2 全序列，通過遺傳進(jìn)化分析鑒定了重組事件的可能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 株P(guān)CV2 重組序列，其親本毒分別為PCV2a 和PCV2b 兩種不同基因型。經(jīng)重組檢測軟件分析，重組位點(diǎn)均發(fā)生在ORF1 區(qū)段內(nèi)，證實重組對PCV2 遺傳變異進(jìn)化的重要性[15]。有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)豬群自然共感染不同基因型PCV2a 和PCV2b 后，在豬體內(nèi)發(fā)生自然重組表明，自然重組發(fā)生在ORF2 基因。該學(xué)者已從不同基因型PCV2 共感染豬體中獲得重組序列，其親本毒分別為PCV2a 和PCV2b，基于獲得的重組序列，構(gòu)建重組毒感染性分子克隆，并在體外進(jìn)行重組毒病毒拯救，獲得的重組毒株能適應(yīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)[16]。Hesse 等（2008）[17]從臨床病料中發(fā)現(xiàn)PCV2a 和PCV2b 重組序列，該重組毒ORF1 和ORF2 基因分別來自PCV2a 和PCV2b 兩種不同基因型，證實當(dāng)豬群中有不同基因型PCV2 共同感染時自然重組現(xiàn)象可能會發(fā)生。以上所述的PCV2 重組研究的報道，均通過對來自臨床樣品的PCV2 序列分析所得，沒有經(jīng)體內(nèi)或體外實驗證實。相反，筆者通過不同基因型PCV2a 和PCV2b體外共感染試驗首次證實，不同基因型PCV2 體外共感染能發(fā)生重組突變體，其重組機(jī)率較小，獲得重組突變體重組位點(diǎn)位于ORF1 和ORF2 基因連接處及復(fù)制原點(diǎn)附近，該發(fā)現(xiàn)與上述報道不同。試驗進(jìn)一步表明，重組毒具有很高體外的繁殖能力，與親本毒呈顯著差異。通過體外有限稀釋法分離到該重組毒，體外試驗表明，重組毒其繁殖效率、抗原性等均發(fā)生改變，與親本毒存在明顯差異，而有關(guān)重組毒表型的改變是否影響其致病性，尚需研究證實。

3 PCV1 和PCV2 間的重組

傳統(tǒng)認(rèn)為，PCV1 和PCV2 為同科同屬成員，結(jié)構(gòu)相似，但二者分別以相互獨(dú)立的個體形式存在，從屬于完全不同的病毒。但最新研究表明，用PCV2 型特異性鑒別熒光定量PCR 方法對臨床樣品進(jìn)行檢測，由于某檢測樣品針對的ORF1 和ORF2CT 值不同，偶然發(fā)現(xiàn)一變異毒株，經(jīng)病毒分離及序列分析發(fā)現(xiàn)，該變異毒株為PCV1 和PCV2 重組毒，該重組毒ORF1和ORF2 分別來自PCV1 和PCV2a 基因型病毒，按照國際PCV2 命名法則，將ORF1 來源放在前面，ORF2 來源放在后面，因此，新出現(xiàn)的PCV 可以命名為PCV1/2a。全基因核苷酸序列相似性比較發(fā)現(xiàn)，該重組毒與PCV1，PCV2a 和PCV2b 基因型的相似性分別為86.4%，88.7%和86.5%。至于該新重組毒的起源尚不明確，其致病性和抗原性有待進(jìn)一步證實[18]。

4 小結(jié)與展望

自2004 年以來，PCV2 成為危害世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的頭號殺手，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有關(guān)PCV2 同種基因型或不同基因型共感染時自然重組的報道日見增多，重組機(jī)制及重組毒對豬群的致病性尚無明確報道。當(dāng)前形勢下，應(yīng)關(guān)注PCV 自然重組，因為PCV2 重組毒株的出現(xiàn)為該病毒及引起的相關(guān)疾病提出嚴(yán)重挑戰(zhàn)。隨著PCV2 疫苗的廣泛使用，免疫覆蓋率越來越大，作為病原而言，其生活環(huán)境面臨宿主先天性和主動免疫的壓力下，病原如何能逃避機(jī)體的免疫攻擊而在宿主體內(nèi)存活下來成為病毒遺傳進(jìn)化的驅(qū)動力?；谝陨涎芯浚茰yPCV2 發(fā)生自然重組逃避機(jī)體免疫監(jiān)控的機(jī)制有：（1）PCV2 通過重組引起其抗原性的改變，導(dǎo)致疫苗免疫抗體喪失或降低對病毒粒子的親和力。（2）經(jīng)尚未明確的分子機(jī)制，重組雜交后病毒獲得較親本毒更高的繁殖效率，導(dǎo)致機(jī)體免疫對大量病毒的中和能力不足。（3）臨床上不同基因型PCV2 及重組毒共存，為世界范圍內(nèi)豬圓環(huán)病的防治提出警示。至于PCV2 在疫苗免疫的壓力下，重組毒是否會成為一種強(qiáng)有力的生存形式值得研究者關(guān)注。