我國(guó)東北地區(qū)格子狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良家系的TGFBI基因突變研究

胡 瑩，劉 馳

0引言

格子狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良(lattice corneal dysprothy，LCD)是一種常染色體顯性遺傳病，是角膜基質(zhì)層營(yíng)養(yǎng)不良，以雙側(cè)角膜基質(zhì)層折光格子線條的淀粉樣沉積物為特征[1]，可以發(fā)生在任何年齡。其分為四種類型LCDⅠ、LCDⅡ、LCDⅢ和LCDⅢA型，還有一種兼具LCDⅠ的某些特征和LCDⅢ或LCDⅢA的一些特征，由于不能歸屬于任何一型，因此在2002年法國(guó)學(xué)者Schmitt-Bernard等建議將其定義為中間型LCD即LCDi(intermedium)型[2-3]。其中最常見的是LCDⅠ。目前報(bào)道的LCDⅠ的基因突變，除伴有全身淀粉樣變性的LCDⅡ型(又稱Meretoja綜合征)為9號(hào)染色體Gelsolin基因突變外，其余均為位于染色體5q31上的TGFBI基因(transforming growth factor β-induced gene)，TGFBI基因也是第一個(gè)被確定的角膜營(yíng)養(yǎng)不良的致病基因[4]。它包含17個(gè)外顯子，其中第4、11、12、13、14外顯子被認(rèn)為是突變熱點(diǎn)[5]。我們對(duì)我國(guó)東北地區(qū)一家系中家族性LCDⅠ患者的TGFBI基因進(jìn)行突變檢測(cè)，了解我國(guó)東北地區(qū)家族性LCD的臨床表型和突變類型。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象于2017-02選取來自中國(guó)東北地區(qū)同一家系的2名正常者(Ⅱ∶3和Ⅲ∶2)和3例患者(Ⅲ∶1、Ⅲ∶4、Ⅲ∶5，圖1)為研究對(duì)象。對(duì)該家族所有參與者進(jìn)行裂隙燈檢查，以確定是否受到角膜營(yíng)養(yǎng)不良影響或不受影響，并確定疾病表型。獲得所有參與對(duì)象的詳細(xì)臨床病史，例如發(fā)病年齡、初始體征和癥狀、疾病進(jìn)展、其他眼部治療過程等。從沈陽市第四人民醫(yī)院體檢中心招募了50名健康人作為對(duì)照組，無相關(guān)視力障礙的病史。該家系成員為漢族，無近親聯(lián)姻史，長(zhǎng)期居住遼寧省。本研究已經(jīng)取得沈陽市第四人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在研究之前獲得所有受試者書面知情同意書。本研究中的所有程序都遵循赫爾辛基宣言的原則。

1.2方法

1.2.1DNA提取取外周靜脈血2mL，置于真空采血管中，4℃冰箱保存，1wk內(nèi)應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分別對(duì)TGFBI基因的外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。特異性引物均由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。PCR體系：ddH2O 37.4μL，10×Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物F 2μL，引物R 2μL，DNA模板2μL，LA Taq酶0.4μL。PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火30s(不同引物退火溫度不同，表1)，72℃延伸45s共30個(gè)循環(huán)，最后72℃總延伸7min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)：用2%瓊脂糖電泳，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3μL與1μL甘油溴酚藍(lán)加樣液混合均勻后加入凝膠上樣孔中，進(jìn)行95V恒壓電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE。暗箱式紫外投射儀中成像檢測(cè)，保存圖片。

1.2.3PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?qū)CR產(chǎn)物和引物送華大基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化，并進(jìn)行測(cè)序。將其結(jié)果與GenBank中的原始序列進(jìn)行Blast比對(duì)，并對(duì)所得到的序列圖譜進(jìn)行分析，以確定是否存在基因突變。

2結(jié)果

2.1臨床檢測(cè)結(jié)果通過眼科檢查和追問家族史確定了該家系中有6例患者，其中3例患者(Ⅲ∶1、Ⅲ∶4、Ⅲ∶5)參與本研究。受影響的LCDⅠ受試者表現(xiàn)出類似的臨床特征，除了患者Ⅲ∶5呈現(xiàn)輕度癥狀。該家族中的先證者(Ⅲ∶1)和患者Ⅲ∶4曾就診于我院，最初被診斷為L(zhǎng)CDⅠ。先證者自35歲以來經(jīng)歷了雙側(cè)反復(fù)發(fā)作性眼紅、疼痛、畏光、異物感、流淚等角膜刺激癥狀，并且在過去的10a中雙側(cè)視力進(jìn)行性惡化。裂隙燈檢查顯示中央角膜表面基質(zhì)伴有上皮侵蝕中的各種不同線性沉積物(圖2)。在具有LCDⅠ的該家庭中鑒定出TGFBI基因中的R124C突變。也發(fā)現(xiàn)患者在大約21～25歲時(shí)開始表現(xiàn)出輕微的異物感，并表現(xiàn)出明顯的視力下降。

2.2分子遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果該家系中患者的測(cè)序結(jié)果均發(fā)現(xiàn)TGFBI基因第4外顯子370位點(diǎn)堿基C>T的改變，蛋白質(zhì)由編碼精氨酸的CGC突變?yōu)榫幋a半胱氨酸的TGC，即發(fā)生了R124C突變，為雜合子(圖3)。家系中的正常成員(Ⅱ∶3和Ⅲ∶2)和正常對(duì)照組均未發(fā)生TGFBI基因突變。

2.3生物信息學(xué)分析結(jié)果應(yīng)用Polyphen-2軟件分析突變蛋白的各物種間的保守性結(jié)果顯示(圖4)，該突變氨基酸在各物種間高度保守，并且該突變具有致病性。

3討論

LCDⅠ是一種常染色體顯性遺傳性角膜淀粉樣變性病，伴有嚴(yán)重的視覺缺陷，TGFBI基因突變是LCDⅠ發(fā)病的主要原因。本研究中，在一個(gè)中國(guó)東北地區(qū)LCDⅠ家系中檢測(cè)到TGFBI基因的雜合突變c.370C>T(p.R124C)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGFBI基因的突變至少與5種類型遺傳性角膜營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)病相關(guān)。在所報(bào)道的突變中，TGFBI基因中的R124似乎是全世界各種族群不同類型角膜營(yíng)養(yǎng)不良中檢測(cè)到的“熱點(diǎn)”點(diǎn)突變[6]。同時(shí)，研究也發(fā)現(xiàn)TGFBI基因的第4外顯子中的R124在許多不同物種中高度保守(圖4)，表明該殘基是蛋白質(zhì)的重要功能和結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。因此，研究該疾病的基因突變并鑒定發(fā)病家族的臨床特征和表型-基因型相關(guān)性非常重要。

表1TGFBI基因第4、11、12、13、14外顯子的引物序列和PCR擴(kuò)增條件

外顯子引物序列退火溫度(℃)片段長(zhǎng)度(bp)4FCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGG592964RCGGGGAAGTAAGGCAGATC11FTGACCCTGCTAATGCTCTG6027711RCCAGCATGACCAACTGGG12FAAAATACCTCTCAGCGGGTG5827012RGCCCTGAGGGATCACTACTTAG13FCCAGGCTAATTACCATTCTG6025013RTGAGATATGTCCTGGAGCC14FGGCGACAAGATTGAACTCC5923014RTCTTCTCTCCACCAACGCC

圖1格子狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良家系圖譜。

伴有相同突變甚至在同一家族中的角膜營(yíng)養(yǎng)不良患者的表型變異潛在機(jī)制需要進(jìn)一步研究。因此，雖然已經(jīng)有LCDⅠ家系中R124C突變的表型變異的研究[7]，本研究中還要對(duì)該家族中被診斷為L(zhǎng)CDⅠ的3例患者進(jìn)行基因突變分析，以評(píng)估遺傳異質(zhì)性。在本研究中，具有R124C突變的患者表現(xiàn)出與LCDⅠ類似的臨床特征。雖然患者Ⅲ∶5表現(xiàn)出輕微的癥狀，但它們都具有細(xì)微線性混濁，主要位于角膜基質(zhì)并伴有上皮侵蝕。分子遺傳學(xué)分析對(duì)確定角膜營(yíng)養(yǎng)不良的分類很重要，揭示可靠的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。盡管患者Ⅲ∶5沒有表現(xiàn)出LCDⅠ的典型臨床特征，但是與其他2例患者攜帶相同的R124C突變，因此被診斷為L(zhǎng)CDⅠ。這表明遺傳分析可能用于產(chǎn)前和產(chǎn)后DNA診斷。在裂隙燈檢查受影響的家庭成員時(shí)，發(fā)現(xiàn)他們的角膜上皮均被侵蝕，表現(xiàn)為畏光和流淚。有學(xué)者觀察發(fā)現(xiàn)角膜營(yíng)養(yǎng)不良的患者Bowman膜異常形態(tài)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維密度明顯減少甚至消失；損傷的Bowman膜很可能不能為角膜神經(jīng)生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，從而導(dǎo)致角膜沉積。如果這種角膜營(yíng)養(yǎng)不良是由于缺乏營(yíng)養(yǎng)，這種疾病可能用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療。TGFBI蛋白涉及各種細(xì)胞類型的細(xì)胞黏附和遷移，包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞[8]。因此，患有TGFBI R124C突變的患者可能表現(xiàn)出角膜上皮細(xì)胞與整個(gè)上皮層之間連接的松弛，導(dǎo)致該家族中角膜基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。此外，神經(jīng)纖維不能長(zhǎng)入Bowman層導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致角膜上皮脫落(圖2)。

圖2先證者和Ⅲ∶5患者的角膜裂隙燈顯微鏡照片A：先證者的角膜上皮混濁，基質(zhì)層中典型的格子狀線條；B：先證者的角膜上皮熒光素染色顯示上皮缺損；C：Ⅲ∶5 患者(17歲)，角膜上片小片缺損，基質(zhì)層中單個(gè)的格子狀線條。

圖3分子遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果A：家系中患者TGFBI基因4號(hào)外顯子第370個(gè)堿基呈雜合性點(diǎn)突變C→T，導(dǎo)致編碼該密碼子的精氨酸變成半胱氨酸；B：正常的4號(hào)外顯子序列。

圖4Polyphen-2軟件分析結(jié)果，該突變氨基酸在各物種間高度保守，并且該突變具有致病性。

總之，在具有LCDⅠ的中國(guó)東北地區(qū)家庭中鑒定了TGFBI基因的突變。目前的研究結(jié)果表明了LCDⅠ的臨床特征，并在該家族中揭示了明確的基因型相關(guān)表型，這可能有助于進(jìn)一步理解TGFBI基因突變?cè)贚CDⅠ發(fā)展中的作用。然而，患者角膜層的組成仍然未知，因此其具體的潛在機(jī)制需要進(jìn)一步研究，且需要未來的功能性研究以確認(rèn)TGFBI基因的作用和疾病發(fā)生的潛在機(jī)制。