年齡相關(guān)性黃斑變性患者血清miR-23a和miR-34a的表達(dá)水平及臨床意義

李慧俐，孫雅楠，韓新剛

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種致盲性退行性眼底病變，可分為干性和濕性?xún)煞N病理類(lèi)型[1]。目前，ARMD診斷主要依靠臨床癥狀結(jié)合眼底攝影、光學(xué)相干斷層掃描和熒光素眼底血管造影檢查結(jié)果，但干性ARMD臨床癥狀不明顯，早期很難診斷，且早期診斷后無(wú)有效的預(yù)防措施[2]。因此，識(shí)別潛在相關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)早期診斷、預(yù)防治療，改善ARMD預(yù)后具有重要的臨床意義。miRNA參與人體多種生理病理過(guò)程，近年來(lái)研究表明，miRNA在視網(wǎng)膜發(fā)育和病變中發(fā)揮重要調(diào)控作用[3]。有研究對(duì)ARMD患者進(jìn)行循環(huán)miRNA檢測(cè)，結(jié)果顯示216個(gè)miRNA表達(dá)異常，多個(gè)miRNA顯示出潛在的診斷價(jià)值[4]。研究表明，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a表達(dá)異常，可能在ARMD發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用[5]。因此，本研究探討miR-23a和miR-34a在ARMD患者血清中的表達(dá)水平，分析其在ARMD發(fā)病中的可能調(diào)控途徑及臨床診斷意義，以期為ARMD早期診斷和治療提供理論參考。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2015-05/2018-02在我院診治的ARMD患者102例為研究對(duì)象(病例組)，其中男52例，女50例；年齡53～75(平均62.58±9.32)歲；根據(jù)美國(guó)國(guó)家眼科研究所關(guān)于ARMD的分期標(biāo)準(zhǔn)[6]：早期34例，中期38例，晚期30例。另選取同期于我院體檢健康者70例作為對(duì)照組，其中男36例，女34例；年齡50～80(平均61.73±11.42)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)ARMD患者均符合《年齡相關(guān)性黃斑變性診斷指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)對(duì)照組受檢者眼底檢查等各項(xiàng)身體指標(biāo)正常，且無(wú)眼部疾病家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并高血壓、糖尿病及心腦血管疾病者；(2)合并惡性腫瘤及感染性疾病者；(3)合并肝、腎功能損傷及結(jié)締組織病變者；(4)視力正常的年齡相關(guān)性玻璃膜疣、脈絡(luò)膜黑色素瘤及中心性滲出性脈絡(luò)膜炎患者；(5)合并免疫性、代謝性相關(guān)疾病及其它全身疾病者。病例組和對(duì)照組受檢者性別、年齡等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，病例組不同分期組患者一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受檢者均知情并自愿參與本研究。

1.2方法

1.2.1血樣采集病例組患者于確診后次日清晨采集空腹肘靜脈血5mL，對(duì)照組受檢者于體檢當(dāng)日采集空腹肘靜脈血5mL，采集血樣于4℃條件下，離心10min，分離血清保存于超低溫冰箱中。

1.2.2miR-23a和miR-34a檢測(cè)采用Trizol裂解液(Invitrogen公司)提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)(SuperScriptTMⅢ一步法RT-PCR系統(tǒng)和SYBR@Green實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液均購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司)。RT-PCR反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性30s；93℃變性30s，58℃/60℃退火30s，72℃延長(zhǎng)30s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)10min。引物序列：miR-23a正向5’-CAGGCGGGTAGTAGATG-3’，反向5’-AGGGACGGGCATGGAAAGG-3’；miR-34a正向5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3’，反向5’-GCCATTCAGGCTAGCAGC-3’；U6內(nèi)參正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。 引物均合成于上海生工生物工程有限公司。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-23a和miR-34a相對(duì)表達(dá)量。

分期例數(shù)miR-23a相對(duì)表達(dá)量miR-34a相對(duì)表達(dá)量早期341.22±0.281.83±0.37中期381.43±0.36b2.04±0.48b晚期301.81±0.51b,d2.35±0.59b,d F18.7509.278P<0.01<0.01

注：bP<0.01vs早期；dP<0.01vs中期。

1.2.3TNF-α和NF-κB檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測(cè)兩組受檢者血清TNF-α和NF-κB水平，具體操作方法嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本研究所使用人TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(雙抗體夾心法)和NF-κB檢測(cè)試劑盒(ELISA法)均購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本研究采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0分析數(shù)據(jù)。血清因子表達(dá)水平等計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。血清miR-23a、miR-34a與TNF-α、NF-κB的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。采用受試者工作特征曲線(xiàn)(receiver operating characteristic，ROC)分析血清miR-23a和miR-34a對(duì)ARMD的診斷價(jià)值。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組受檢者血清miR-23a和miR-34a表達(dá)水平病例組患者血清miR-23a和miR-34a相對(duì)表達(dá)量(1.47±0.36和2.06±0.54)均高于對(duì)照組(0.61±0.18和0.83±0.22)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.455、18.044，均P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.2病例組不同分期患者血清miR-23a和miR-34a表達(dá)水平病例組不同分期患者血清miR-23a和miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且晚期患者血清miR-23a和miR-34a相對(duì)表達(dá)量顯著高于中期和早期患者，中期患者血清miR-23a和miR-34a相對(duì)表達(dá)量顯著高于早期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1，圖2。

2.3兩組受檢者血清TNF-α和NF-κB水平病例組患者血清TNF-α和NF-κB水平(135.62±34.57pg/mL和613.91±102.33ng/L)均高于對(duì)照組(65.98±15.83pg/mL和214.35±51.86ng/L)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.748、7.727，均P<0.01)。

圖1兩組受檢者血清miR-23a和miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較A：兩組受檢者血清miR-23a相對(duì)表達(dá)量；B：兩組受檢者血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量。bP<0.01vs對(duì)照組。

圖2病例組不同分期患者血清miR-23a和miR-34a相對(duì)表達(dá)量比較A：病例組不同分期患者血清miR-23a相對(duì)表達(dá)量；B：病例組不同分期患者血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量。bP<0.01vs早期；dP<0.01vs中期。

圖3病例組患者血清miR-23a、miR-34a與TNF-α、NF-κB的相關(guān)性分析A：血清miR-23a相對(duì)表達(dá)量與TNF-α水平的相關(guān)性；B：血清miR-23a相對(duì)表達(dá)量與NF-κB水平的相關(guān)性；C：血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量與TNF-α水平的相關(guān)性；D：血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量與NF-κB水平的相關(guān)性。

圖4血清miR-23a和miR-34a診斷ARMD的ROC曲線(xiàn)分析。

2.4病例組患者血清miR-23a、miR-34a與TNF-α、NF-κB的關(guān)系病例組患者血清miR-23a相對(duì)表達(dá)水平與TNF-α、NF-κB水平均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.798、0.720，均P<0.01)；血清miR-34a表達(dá)水平與TNF-α、NF-κB水平均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.814、0.740，均P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.5血清miR-23a和miR-34a對(duì)ARMD的診斷價(jià)值分析血清miR-23a診斷ARMD的ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.831(0.767～0.884)，診斷敏感性為75.49%，特異性為77.14%；血清miR-34a診斷ARMD的ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.867(0.807～0.914)，診斷敏感性為79.41%，特異性為78.57%，見(jiàn)圖4。

3討論

ARMD主要發(fā)生于45歲以上人群，患病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，已成為目前老年人視力慢性不可逆性損傷及致盲的重要眼病之一[8]。流行病學(xué)研究表明，心腦血管疾病、慢性腎病、糖尿病及遺傳、衰老等是ARMD的危險(xiǎn)因素[9]。ARMD主要臨床特點(diǎn)為進(jìn)行性色素上皮萎縮和脈絡(luò)膜新生血管形成及其引發(fā)的一系列病理改變，其發(fā)病過(guò)程復(fù)雜，涉及多種因素，但具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，多認(rèn)為與免疫炎癥、氧化損傷、遺傳及基因突變等密切相關(guān)[10]。近年多項(xiàng)研究表明，ARMD患者存在不同程度氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，與病變嚴(yán)重程度有關(guān)，但介導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)生的相關(guān)因子及途徑尚不明確。ARMD病理相關(guān)研究表明，其病變組織中存在大量巨噬細(xì)胞，通過(guò)分泌炎性因子，參與脈絡(luò)膜新生血管形成及纖維血管組織增生過(guò)程[11]。

色素上皮細(xì)胞能夠消化、吞噬壞死、脫落的感光細(xì)胞，維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，但這個(gè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量脂肪醛自由基和氧自由基，同時(shí)色素細(xì)胞受強(qiáng)光照射也會(huì)誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生，大量氧自由基在眼底堆積可最終導(dǎo)致色素上皮細(xì)胞功能損傷及視網(wǎng)膜氧化損傷[12]?，F(xiàn)已證實(shí)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是ARMD的重要病理機(jī)制。研究表明，miRNA與色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)，如miR-184在維持色素上皮細(xì)胞正常吞噬功能中發(fā)揮重要調(diào)控作用[13]。此外，miRNA還與ARMD脈絡(luò)膜新生血管形成、免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)[14]。 miR-23a是miR-23亞型之一，其在細(xì)胞分化、凋亡及炎癥反應(yīng)、心臟病變中扮演重要角色[15]。Li等[16]研究表明，H2O2誘導(dǎo)色素上皮細(xì)胞凋亡時(shí)miR-23a表達(dá)上調(diào)，并可明顯增加色素上皮細(xì)胞對(duì)H2O2的敏感性，而抑制miR-23a表達(dá)則能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的色素上皮細(xì)胞死亡，提示 miR-23a能夠促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與正常者相比，miR-23a和miR-34a在ARMD患者血清中表達(dá)明顯上調(diào)，且血清miR-23a和miR-34a相對(duì)表達(dá)量在不同分期患者中呈逐漸升高趨勢(shì)。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成血-眼屏障，而TNF-α是破壞其屏障功能和血管生成的主要炎性細(xì)胞因子，通過(guò)p38 MAPK途徑在ARMD病理過(guò)程中發(fā)揮作用[17]。為探究血清miR-23a和miR-34a表達(dá)異常與ARMD氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)水平的關(guān)系，本研究檢測(cè)ARMD患者血清TNF-α和NF-κB水平，與正常者相比，ARMD患者血清TNF-α和NF-κB水平均顯著升高，相關(guān)性分析顯示，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a分別與TNF-α和NF-κB呈正相關(guān)關(guān)系，表明血清miR-23a和miR-34a表達(dá)上調(diào)與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

衰老的主要特征包括線(xiàn)粒體功能失調(diào)、氧化應(yīng)激、慢性低度炎癥及細(xì)胞凋亡率增加等。Rippo等[18]研究表明，miR-34a、miR-146a等miRNA在ARMD患者血清中過(guò)度表達(dá)，其靶向Bcl-2基因在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和年齡相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用，其調(diào)節(jié)作用可以介導(dǎo)衰老細(xì)胞中線(xiàn)粒體完整性和功能喪失，誘導(dǎo)或促進(jìn)炎癥反應(yīng)和與年齡有關(guān)的疾病。Bhattacharjee等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a通過(guò)介導(dǎo)小膠質(zhì)富集觸發(fā)受體的下調(diào)，調(diào)節(jié)吞噬反應(yīng)，在ARMD氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a和miR-34a分別與TNF-α和NF-κB呈正相關(guān)關(guān)系，推測(cè)血清miR-23a和miR-34a表達(dá)升高可促進(jìn)機(jī)體炎癥因子TNF-α的釋放，激活NF-κB途徑，通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在ARMD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。光學(xué)相干斷層掃描和熒光素眼底血管造影大大提高了ARMD早期診斷效率，在ARMD診斷中各具優(yōu)勢(shì)，但由于部分患者早期臨床癥狀不明顯或無(wú)癥狀，導(dǎo)致上述檢查存在一定的局限性。本研究采用ROC曲線(xiàn)分析顯示，血清miR-23a診斷ARMD的ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.831，診斷敏感性為75.49%，特異性為77.14%；血清miR-34a診斷ARMD的ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.867，診斷敏感性為79.41%，特異性為78.57%。表明血清miR-23a和miR-34a對(duì)ARMD具有一定診斷價(jià)值。

綜上所述，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)促進(jìn)炎性因子分泌，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)ARMD發(fā)生、發(fā)展，推測(cè)抑制miR-23a和miR-34a表達(dá)能夠降低炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解病情，提高治療療效，但其是否是ARMD治療新靶點(diǎn)及其治療效果仍有待進(jìn)一步深入研究。早期診斷對(duì)ARMD預(yù)防治療和改善預(yù)后至關(guān)重要，檢測(cè)血清miR-23a和miR-34a水平有助于早期輔助診斷，對(duì)早期干預(yù)治療具有一定的臨床指導(dǎo)意義。