玄黃膏藥對急性軟組織損傷大鼠損傷組織中IL－1β、TNF－α含量的影響＊

程 延，趙曉蕓，王敏娟，范俊超，楊振興，竇群立

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院骨傷二科（西安710003）；2.西電集團醫(yī)院急診科（西安710077）；3.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨傷科（咸陽712000）

急性軟組織損傷在日常生活中十分常見，不僅影響人們的日常生活和工作，而且還會帶來極大的精神痛苦與醫(yī)療費用支出［1－2］。更為嚴重的是，如果此類損傷不及時治療和后期正規(guī)康復，往往會出現(xiàn)慢性、持續(xù)性疼痛，影響人們損傷肢體的功能恢復及正?；顒?，重者甚至導致自理能力障礙［3］。中醫(yī)藥治療急性軟組織損傷具有很多優(yōu)勢，尤其以外用藥膏、膏藥等最為廣泛，效果顯著［4］。多年來我們使用純中藥制劑玄黃藥膏治療急性軟組織損傷患者，取得明顯效果，而且該藥使用方法簡單，使用中未發(fā)生毒副作用及過敏反應等［5］。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，通過實驗研究玄黃藥膏對大鼠急性軟組織損傷模型損傷組織中IL－1β、TNF－α含量的變化，進一步探討其治療急性軟組織損傷的機理。

材料與方法

1 實驗動物 SD大鼠72只，雌雄各半，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK9（陜）：2014－006）。適應性喂養(yǎng)3d，精選合格飼料，每天清洗籠具，保持室內(nèi)宜溫、宜濕及室內(nèi)清潔。

2 實驗藥物與試劑 玄黃藥膏組成：酒大黃15 g，梔子30g，蒲公英9g，乳香、沒藥各8g，?蟲3g。所有藥材購于陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，藥物符合國家中草藥質(zhì)量規(guī)定。

藥膏制備：將以上6味中藥按100～120目粉為細末備用，置于500ml圓底燒瓶中，稱重。然后按1∶1比例向燒瓶中加入凡士林攪拌均勻，制成玄黃藥膏，密封，4℃冰箱保存，備用。藥膏制作在陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑中心完成。

實驗試劑：扶他林軟膏購自諾華制藥西安經(jīng)銷商。IL－1β試劑盒購自?？藸柹锟萍脊疚靼步?jīng)銷商。TNF－α試劑盒購自圖赫實業(yè)（上海）有限公司。

3 實驗方法

3.1 動物分組與造模：大鼠適應性喂養(yǎng)3d后，隨機分為模型對照組（A組）、扶他林組（B組）、玄黃藥膏組（C組）三組，每組24只。實驗前1天用8%硫化鈉涂抹于每組大鼠的右大腿，進行術(shù)前脫毛處理，并且對打擊部位進行標記處理、編號；實驗當天用質(zhì)量100 g的砝碼，從50cm高度的固定位置經(jīng)由塑料管落下，使砝碼準確打擊到大鼠肢體的標記處，反復進行3次，觀察損傷模型。

3.2 治療方法：造模成功30min后開始給藥，玄黃藥膏組、扶他林組分別外敷玄黃藥膏和扶他林各3g，空白對照組給予凡士林外敷。24h換藥1次，共10d，各組治療完成后用醫(yī)用的紗布覆蓋創(chuàng)面，膠布固定。

3.3 檢測指標：在治療后第1、3、7、10天，每組分別處死6只動物，取治療處表皮，組織剪剪下?lián)p傷中心處組織，醫(yī)用鹽水漂洗1min，濾紙將其吸收干后用天平稱重，取（100±5）mg，10mg組織中配備生理鹽水0.5ml，組織在勻漿器里面均勻的研磨，15min后觀察并且等到勻漿液看上去呈均勻一致懸濁液時，其容器里面均勻的處理到達15min，等到勻漿液看上去呈上一次處理差不多均勻的液體時，再將組織放于醫(yī)用鹽水漂洗1min，吸干后，再重復稱取，配醫(yī)用鹽水，組織勻漿等，等到勻漿的組織又一次呈均勻一致的時候去其液體。再將其放到高速冷凍離心機中進行處理15 min，將上面的液體收集起來，放置于－20℃冰箱中備用。用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）測定損傷組織中IL－1β、TNF－α含量，具體操作步驟按照試劑盒操作說明完成。

4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件包進行統(tǒng)計學分析，檢測結(jié)果以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

治療后，玄黃藥膏組動物損傷組織中IL－1β、TNF－α含量逐漸降低，且隨治療時間延長，降低越明顯，在各時間點均低于空白對照組，優(yōu)于扶他林組（P＜0.05），組內(nèi)及組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同時間各組大鼠損傷組織中IL－1β、TNF－α含量變化比較見表1、2。

表1 各組IL－1β含量比較（pg／ml）

表2 各組TNF－α含量比較（pg／ml）

討 論

急性軟組織損傷屬中醫(yī)“急性筋傷”范疇，指身體遭受外力作用，引起皮膚、筋膜、肌肉、韌帶、肌腱等損傷，表現(xiàn)為局部疼痛、腫脹、皮膚青紫瘀斑、肢體活動障礙等。損傷處常常因為出血，組織缺血缺氧等，發(fā)生急性無菌性炎癥反應，導致疼痛敏感性增加而疼痛明顯；炎癥致痛因子反過來又使血管收縮，導致缺血缺氧加重，形成惡性循環(huán)。其病理變化主要以局部炎癥反應和組織修復。研究表明［6］，急性軟組織損傷的病理過程，主要是損傷的組織發(fā)生無菌性炎癥反應，導致炎癥介質(zhì)和促炎細胞因子釋放，其中IL－1β是炎性反應過程中一個重要介質(zhì)，組織受損后，炎癥部位及脊髓水平的濃度都會升高，而且還能誘導其他促炎因子釋放，促進、維持炎癥反應，引發(fā)炎性疼痛。外周組織IL－1β的釋放，使炎癥傷害信息傳入敏化，并誘發(fā)機械和熱痛覺過敏；脊髓水平IL－1β的釋放可以通過不同的機制來調(diào)節(jié)疼痛，這可能與急性疼痛轉(zhuǎn)化為慢性疼痛且慢性疼痛長期持續(xù)的存在有關(guān)。TNF－α具有廣泛的生物學效應，可誘導細胞凋亡，使機體發(fā)熱，誘導促進炎癥反應和誘導產(chǎn)生IL－1、IL－2等多種細胞因子，誘發(fā)和擴大炎癥反應，通過刺激、生成超氧化物，釋放出溶酶體而損傷組織細胞，使炎癥介質(zhì)聚集，TNF含量與創(chuàng)傷嚴重程度呈正相關(guān)。楊進等［7］應用消腫止痛膏治療角叉菜膠誘導的大鼠足腫脹，發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)IL－1β、TNF－α含量較模型組降低（P＜0.05），說明消腫止痛膏通過調(diào)節(jié)大鼠角叉菜膠足腫脹血清內(nèi)炎癥因子IL－1β、TNF－α水平抑制急性炎癥發(fā)生發(fā)展過程。

中藥外治是中醫(yī)治療方法的一種重要形式，也最具特色。清徐大椿的《醫(yī)學源流論》說：“外科治法，最重外治”。清吳師機的《理瀹駢文》指出：“外治之理，即內(nèi)治之理；外治之藥，即內(nèi)治之藥，所異者法耳”。外治法在中醫(yī)各科應用廣泛，其中藥膏在骨傷科使用非常廣泛，其制作、使用方便，價格低廉，深受患者信賴和歡迎。一般適用于損傷初中期［8］。中藥經(jīng)過皮膚吸收，直接作用于損傷組織局部，可以在損傷部位維持相對穩(wěn)定的血藥濃度，發(fā)揮藥物作用，達到活血祛瘀、消腫止痛的作用［9］。中藥外治不受口服給藥所帶來的胃腸道酶及消化液的影響，無明顯的毒副作用，是治療軟組織損傷不可或缺的一種治療方式［10］。

中醫(yī)學認為，本病病機主要是氣滯血瘀、筋脈阻滯，治療應以活血化瘀、消腫止痛為法。本實驗以“活血化瘀、消腫止痛”為法，組外治方“玄黃藥膏”，用于治療急性軟組織損傷（急性筋傷）患者，中醫(yī)證屬“氣滯血瘀”型，經(jīng)多年應用，效果顯著。方中大黃、?蟲為君藥，用以破瘀通經(jīng)、消腫止痛，乳香、沒藥輔助活血、行氣、消腫，梔子、蒲公英清熱舒筋，助大黃清泄瘀熱之力。全方共奏活血祛瘀、消腫止痛之效?，F(xiàn)代藥理研究表明，大黃中的大黃素可以抑制炎癥因子生成，對TNF和IL－1具有十分明顯的抑制作用［11］；可降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠致炎關(guān)節(jié)滑膜細胞中PGE2和TNF－α水平；可提高血漿滲透壓，使組織水分向血管內(nèi)轉(zhuǎn)移，以補充血容量，降低血漿黏度［12］。梔子中格尼帕素及去羥梔子甙對小鼠醋酸扭體反應有明顯的抑制作用，同時具有顯著的鎮(zhèn)痛效果，乳香、沒藥提取物具有強烈的鎮(zhèn)痛作用。蒲公英有明顯的抗菌、抗病毒作用，這和其清熱解毒的功效聯(lián)系緊密。資料表明［13］，活血化瘀藥可以降低毛細血管通透性，減少炎癥滲出及紅細胞外漏，對局部血液循環(huán)尤其是微循環(huán)有修復和恢復作用，從而改善組織缺血缺氧狀態(tài)，恢復正常的新陳代謝，加快損傷組織修復。能夠促進大鼠急性軟組織損傷模型損傷部位腫脹、瘀血消散，加快組織修復。這與中醫(yī)關(guān)于筋傷的認識機理及辨證論治是相吻合。

本項目前期研究顯示［14］，玄黃藥膏能夠明顯降低損傷組織中IL－6和PGE2含量（P＜0.05）。本次實驗結(jié)果表明，玄黃藥膏組動物損傷組織中IL－1β和TNF－α的含量明顯低于空白對照組，并優(yōu)于扶他林組（P＜0.05），說明玄黃藥膏具有明顯的抑制局部損傷組織中炎癥因子產(chǎn)生的作用，從而減輕局部炎癥反應。本實驗證實，玄黃藥膏可以顯著降低損傷組織中IL－1β、TNF－α含量，從而有效減少損傷組織中炎性細胞浸潤、組織出血、血管擴張，抑制一系列炎癥反應，使痛覺感受器敏感性降低，痛閾升高以鎮(zhèn)痛。其機理可能與減少炎性與促炎介質(zhì)分泌和釋放，促進炎性因子代謝，有效降低損傷軟組織的炎性反應有關(guān)。