丹酚酸B對糖尿病大鼠腎纖維化的改善作用及其機(jī)制

張 旭，朱元美，唐保露，任尤楠，陶善珺，楊解人，鄭書國,3,4

(皖南醫(yī)學(xué)院 1. 藥理學(xué)教研室、2. 解剖學(xué)教研室、3. 定量藥理研究所、4. 藥物研發(fā)中心，安徽 蕪湖 241002)

糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重和最常見的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的最重要原因之一，若不及時(shí)采取措施，可最終發(fā)展成為慢性腎衰竭或尿毒癥，從而危及患者生命[1]。糖尿病腎病的主要病理特征是腎纖維化，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的異常增殖及由此導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)的過度堆積[2]。大量研究表明，氧化應(yīng)激在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[3]，而轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)/Smad信號(hào)通路的異常激活是糖尿病腎病腎纖維化的主要分子機(jī)制[4]。因此，有效改善糖尿病氧化應(yīng)激狀態(tài)和調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路，成為防治糖尿病腎病腎纖維化、改善糖尿病預(yù)后的重要措施之一。

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是丹參的主要成分之一，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能明顯抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)活化和INS-1細(xì)胞凋亡[5]。Sal B可有效抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，減少膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌[6]，但對其能否抑制糖尿病腎臟纖維化目前研究較少。本研究采用高糖高脂飲食，合并腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型，觀察Sal B對糖尿病大鼠腎纖維化的改善作用，并從TGF-β1/Smad信號(hào)通路探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量(220±20)g，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。

1.2藥物與試劑Sal B(純度80%)，西安文竹生物科技有限公司；STZ，Sigma公司；血糖儀及血糖試紙，三諾生物傳感股份有限公司；尿微量白蛋白(urine micro-albumin，UAlb)檢測試劑盒，上海生物科技有限公司；I型和III型膠原蛋白檢測試劑盒、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(serum creatinine, SCr)檢測試劑盒，南京建成生物科技有限公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)，碧云天生物技術(shù)研究所；TGF-β1抗體、p-Smad2、Smad2抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Smad7 抗體，武漢博士德生物工程有限公司。

1.3儀器高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；M200 PRO多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司)；電泳、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Proteinsimple公司)；Axio Vert.A1顯微成像系統(tǒng)(Carl Zeiss公司)。

2 方法

2.1糖尿病模型的建立與給藥SD大鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水。隨機(jī)選取10只作為正常對照組，普通飼料喂養(yǎng)。其余大鼠喂飼高糖高脂飼料(10%豬油、10%蔗糖、5%蛋黃粉、1%膽固醇和 74%普通飼料)4周后，禁食12 h，腹腔注射1% STZ溶液(40 mg·kg-1，0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液配制，pH 4.4)誘導(dǎo)糖尿病，1周后以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol·L-1作為糖尿病模型建立成功。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組、Sal B低劑量組(Sal B 80)、Sal B高劑量組(Sal B 160)，Sal B各組每天灌胃給予Sal B(80、160 mg·kg-1·d-1)，正常對照組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水，連續(xù)6周。其間每周稱量體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。

2.2生化指標(biāo)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用代謝籠收集大鼠24 h尿液，按試劑盒說明檢測尿微量蛋白含量；大鼠禁食12 h，血糖試紙測定空腹血糖水平；1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，按試劑盒說明測定SCr、BUN、MDA、TAC水平及SOD活力。

2.3腎纖維化檢測腹主動(dòng)脈取血后，摘取大鼠腎臟，切取部分腎組織以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、5 μm厚切片，梯度乙醇脫水，按試劑盒說明進(jìn)行Masson染色，鏡下觀察腎組織膠原纖維水平。取腎組織，制取10%組織勻漿，ELISA法測定腎組織I型和III型膠原含量，定量分析腎臟纖維化水平。

2.4Westernblot檢測取腎組織，RIPA 裂解液(含磷酸酶和蛋白酶抑制劑)裂解組織，12 000×g、4 ℃離心10 min后收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，分別加入TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad7和β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯色，凝膠圖像分析儀分析目的條帶光密度，結(jié)果以p-Smad2/Smad2或TGF-β1/β-actin、Smad7/β-actin表示。

3 結(jié)果

3.1SalB對糖尿病大鼠BUN、UAlb、SCr的影響由Tab 1可見，糖尿病大鼠BUN、SCr和UAlb水平均明顯高于正常對照組(P<0.01)，說明糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯腎功能損害。給予Sal B能明顯降低糖尿病大鼠BUN、SCr和UAlb水平(P<0.05，P<0.01)，提示Sal B可有效改善糖尿病大鼠腎功能損害。

Tab 1 Effect of Sal B on BUN, UAlb and SCr in diabetic rats n=7～8)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.2SalB對糖尿病大鼠腎纖維化的影響Fig 1的Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠腎組織細(xì)胞間隙清晰可見，腎間質(zhì)膠原纖維分布極少，染色較淡。而糖尿病模型組大鼠腎小球系膜基質(zhì)增多，腎間質(zhì)膠原組織增多，細(xì)胞間質(zhì)有明顯藍(lán)色深染的膠原纖維。與模型組相比，Sal B各組大鼠腎組織膠原染色均明顯較少。

Fig 1 Effect of Sal B on renal fibrosis (Masson staining×400)

A: Control group; B: Model group; C: Sal B 80 group; D: Sal B 160 group.

為了定量分析Sal B對糖尿病大鼠腎纖維化的影響，本研究又檢測了大鼠腎組織膠原蛋白含量。如Tab 2所示，模型組大鼠腎組織I型和III型膠原蛋白含量均明顯高于正常對照組(P<0.01)，而給予Sal B可明顯減少腎組織膠原蛋白沉積(P<0.05，P<0.01)，這一結(jié)果與Masson染色結(jié)果一致。提示Sal B可明顯改善糖尿病大鼠腎纖維化，減少腎組織膠原蛋白沉積。

Tab 2 Effect of Sal B on renal contents of type Ⅰ and type Ⅲ

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.3SalB對腎組織TGF-β1、Smad7蛋白水平及Smad2磷酸化的影響如Fig 2所示，與正常對照組相比，糖尿病大鼠腎組織TGF-β1蛋白水平和Smad2磷酸化水平均明顯升高(P<0.01)，而Smad7蛋白水平則明顯降低(P<0.01)。給予Sal B可明顯降低TGF-β1和磷酸化Smad2蛋白水平，而Smad7蛋白水平則明顯升高(P<0.05，P<0.01)。這一結(jié)果與Sal B改善糖尿病大鼠腎臟纖維化作用一致，提示Sal B降低腎組織膠原沉積與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。

Fig 2 Effect of Sal B on protein levels of TGF-β1,

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.4SalB對血清TAC、SOD和MDA水平的影響由Tab 3可見，與正常對照組相比，模型組大鼠血清TAC和SOD水平明顯降低，而MDA水平則明顯升高(P<0.01)，提示糖尿病誘發(fā)了明顯氧化應(yīng)激狀態(tài)。給予Sal B后，血清TAC和SOD水平明顯升高，MDA水平明顯下降(P<0.05，P<0.01)，說明Sal B可有效改善糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)。

Tab 3 Effect of Sal B on serum levels of TAC, SOD and

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

4 討論

糖尿病腎病的主要病理特征是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚和腎小管間質(zhì)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[2]。隨著病情的不斷發(fā)展，腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞并形成瘢痕組織，腎單位逐漸減少，腎功能呈進(jìn)行性下降，并最終發(fā)展為終末期腎衰竭。因此，有效抑制腎纖維化成為阻止或延緩糖尿病腎病發(fā)展進(jìn)程、改善糖尿病預(yù)后的重要措施之一。本研究分別采用Masson染色和ELISA法檢測了大鼠腎臟纖維化水平，結(jié)果顯示，糖尿病大鼠出現(xiàn)了明顯腎纖維化，表現(xiàn)為腎組織膠原纖維染色加深，腎組織I型和III型膠原蛋白含量增加，而給予Sal B可明顯減輕糖尿病大鼠腎纖維化，同時(shí)受損的腎功能也明顯改善，提示Sal B可能有助于臨床減輕或延緩糖尿病腎病腎纖維化、改善糖尿病預(yù)后。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad信號(hào)通路的異常激活是糖尿病腎病腎纖維化發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制，抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路可有效減輕糖尿病大鼠腎纖維化，改善腎功能[7]。TGF-β1是TGF-β超家族一員，廣泛參與纖維化、炎癥及自身免疫性疾病等多種病理過程，是介導(dǎo)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[8]。TGF-β1既可趨化并活化炎性細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，又可抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解而促進(jìn)組織纖維化[9]。Smad蛋白是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最重要的下游蛋白和效應(yīng)分子，是TGF-β1信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳至胞核的關(guān)鍵因子[9]。Smad蛋白家族分為受體活化型Smad(Smad2、Smad3)、共同通路型Smad(Smad4)和抑制型Smad(Smad6、Smad7)。當(dāng)TGF-β1與其受體TβRII結(jié)合后，活化的TβRII可磷酸化TβRI，并激活其激酶活性，后者進(jìn)而磷酸化Smad2/3?；罨腟mad2/3與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入胞核，調(diào)控I、III型膠原等靶基因轉(zhuǎn)錄。Smad6/7可直接與TβRI結(jié)合，抑制其對Smad2/3的磷酸化作用[9]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎組織TGF-β1/Smad信號(hào)通路明顯激活，表現(xiàn)為TGF-β1和p-Smad2水平均明顯升高，而Smad7水平明顯下降。給予Sal B可明顯減少TGF-β1和p-Smad2水平，上調(diào)Smad7蛋白水平，說明Sal B可有效抑制糖尿病大鼠腎組織TGF-β1/Smad信號(hào)通路活化，這一結(jié)果與前期報(bào)道Sal B抑制肺成纖維細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路活化作用一致[10-11]，提示Sal B改善糖尿病大鼠腎纖維化與抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路活化有關(guān)。

此外，氧化應(yīng)激也是糖尿病腎病腎纖維化的重要因素之一[12]。長期高血糖一方面可增加機(jī)體活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，另一方面可損傷機(jī)體抗氧化防御體系，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致氧化損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠血清抗氧化能力明顯下降，而氧化損傷標(biāo)志物MDA水平則明顯升高，提示糖尿病大鼠出現(xiàn)了明顯氧化應(yīng)激狀態(tài)。腎臟是對氧化應(yīng)激損傷比較敏感的器官之一，ROS可通過多種途徑促進(jìn)糖尿病腎病腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展[13-14]，如激活TGF-β1/Smad信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，合成大量細(xì)胞外基質(zhì)。ROS還可影響細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。大量研究表明，補(bǔ)充抗氧化劑可有效提高機(jī)體抗氧化能力，減輕糖尿病腎病腎纖維化[15]。本研究也顯示，補(bǔ)充Sal B可明顯提高糖尿病大鼠血清抗氧化能力，降低氧化損傷標(biāo)志物血清MDA水平，說明Sal B可明顯改善糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)，提示Sal B減輕糖尿病大鼠腎纖維化與其改善氧化應(yīng)激狀態(tài)也有關(guān)。

綜上所述，Sal B可明顯改善糖尿病大鼠腎纖維化，改善腎功能，其機(jī)制與改善氧化應(yīng)激狀態(tài)、調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。

(致謝：本研究在皖南醫(yī)學(xué)院中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對實(shí)驗(yàn)室全體工作人員表示感謝。)