絞股藍皂苷通過Nrf2/NF-κB信號通路發(fā)揮抗小鼠急性酒精性肝損傷作用

南 瑛，張 薇，常晉瑞，曹 健，朱永香

(1. 西安醫(yī)學院基礎醫(yī)學部生理學教研室，陜西 西安 710021；2. 第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院心血管內科，陜西 西安 710032)

病理學改變；全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平；熒光定量PCR檢測TNF-α、IL-6 mRNA水平；試劑盒檢測氧化損傷相關指標；Western blot檢測Nrf2和NF-κB信號通路蛋白水平。結果與對照組相比較，酒精模型組動物ALT、AST、TC和TG水平明顯升高；TNF-α和IL-6表達水平明顯升高；氧化損傷產物明顯升高，抗氧化蛋白活性明顯降低；Nrf2信號通路蛋白明顯降低；細胞核內p65蛋白水平明顯升高。不同劑量絞股藍皂苷能夠明顯抑制模型組上述各項指標的變化。結論絞股藍皂苷通過激活Nrf2/NF-κB信號通路有效地保護小鼠急性酒精性肝損傷。

藥用植物絞股藍具有多種藥理學作用，由于其毒性小被國家允許用于保健食品，成為研究開發(fā)的熱點[1]。絞股藍發(fā)揮藥理學作用的主要成分包括皂苷類、黃酮類、多糖類、氨基酸、維生素、微量元素等[2]，其中皂苷類為其主要的藥理學成分。已有研究報道，純化的絞股藍皂苷具有很好的抗氧化作用[3]。酒精性損傷的一個重要機制就是誘導活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生氧化應激。ROS是一大類含氧自由基及其產物的總稱，機體產生的ROS超出了抗氧化防御體系承受范圍就產生了氧化應激，導致組織結構的氧化損傷，最終引起功能障礙和異常，誘導ROS產生是很多有毒有害物質的重要損傷機制。肝臟是代謝酒精的重要器官，也是酒精損傷的主要靶器官。前期已有研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍皂苷片可以改善臨床脂肪肝患者肝臟功能[4]，但絞股藍皂苷對急性酒精肝臟氧化損傷是否有保護作用，以及其作用機制仍不清楚。因此，本研究采用小鼠急性酒精肝損傷模型，觀察絞股藍皂苷對小鼠酒精肝損傷的保護效果，并試圖從氧化損傷角度探討其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級♂8周齡BALB/c小鼠50只，體質量23～25 g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(陜)2014-001。

1.1.2藥物與試劑 絞股藍總皂苷(98%)購自陜西中鑫生物有限公司；酒精(99.7%)購自天津市富宇精細化工有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒，均購自碧云天生物研究所；核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)抗體(ab137550)、抗p65兔單抗(ab32536)、抗谷氨酸半胱氨酸連接酶調節(jié)亞基(glutamate-cysteine ligase regulatory subunit，GCLM)兔單抗(ab124827)、抗血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)兔單抗(ab68477)、抗Lamin B兔單抗(ab133741)，均購自Abcam公司；抗谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)兔多抗(BS2926)、抗Tubulin兔多抗(BS1699)，均購自Bioworld公司；核-漿提取試劑盒、辣根過氧化物酶標記的二抗、化學發(fā)光液，均購自Thermo公司。

1.1.3儀器 高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；酶標儀(TECAN公司)；蛋白電泳儀、轉膜儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組、模型制備及給藥處理 將實驗動物隨機分為5組，分別為對照組、酒精肝損傷模型組、絞股藍皂苷低、中、高劑量組。每日上午絞股藍皂苷組分別灌胃給予50、100、200 mg·kg-1絞股藍皂苷，連續(xù)4 d后，從d 5開始，除了上午給予絞股藍皂苷外，每日下午模型組和各絞股藍皂苷保護組給予50%酒精灌胃，劑量為12.67 mL·kg-1，相當于酒精的劑量為5 g·kg-1，連續(xù)灌胃3 d，共灌胃酒精3 d。至最后一次灌胃4 h后處死實驗動物，取動物全血和肝臟組織進行后續(xù)相應指標檢測。

1.2.2谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)的檢測 處死實驗動物，取外周血分離血清，采用全自動生化分析儀檢測ALT、AST、TC和TG的水平。

1.2.3實時熒光定量PCR法檢測腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素6(interleukin 6，IL-6)mRNA水平 采用TRIzol方法提取肝組織總RNA，常規(guī)定量后反轉錄得到cDNA，進行定量PCR檢測TNF-α和IL-6。PCR反應條件：95 ℃ 10 min，(95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s)×45個循環(huán)。以β-actin為參照，進行mRNA的相對定量分析。2-△△Ct表示目的基因相對于內參基因的表達量。引物序列見Tab 1。

1.2.4肝臟MDA、SOD、CAT和GSH的檢測 取肝組織，用生理鹽水制成10%的肝組織勻漿，蛋白定量后，按照試劑盒說明書進行相關指標檢測。

1.2.5Western blot檢測抗氧化相關通路及蛋白 肝組織總蛋白和核蛋白分別采用碧云天試劑盒和Thermo核-漿提取試劑盒，按照說明書進行分離提取，BCA法進行蛋白定量。常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，轉膜，室溫5%牛奶封閉2 h后，加入相應一抗4 ℃搖床過夜。次日TBST充分洗膜后，加入相應的辣根過氧化物標記的二抗，室溫孵育2 h后，TBST充分洗膜后，滴加化學發(fā)光液發(fā)光、拍照并采用Quantity One軟件進行量化分析。

Tab 1 Primer for detecting TNF-β and IL-6 by qPCR

1.2.6統(tǒng)計學分析 實驗數據采用SPSS 25.0軟件進行方差分析，應用LSD檢驗進行組間的兩兩比較。

2 結果

2.1絞股藍皂苷對酒精性肝損傷小鼠肝臟功能的影響肝損傷會伴隨著肝細胞的破壞，導致血清學指標的明顯改變，ALT、AST、TC和TG是常用的反映肝損傷的肝功能指標。Tab 2的小鼠血清學檢測結果發(fā)現(xiàn)，酒精損傷模型組ALT、AST、TC、TG明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，給予不同劑量絞股藍皂苷保護的小鼠上述指標明顯降低(P<0.05)，并且呈現(xiàn)一定的劑量效應關系。提示絞股藍皂苷對酒精性肝損傷具有保護作用。

2.2絞股藍皂苷對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理形態(tài)學的影響Fig 1的HE染色結果顯示，正常對照組肝小葉結構完整、清楚，肝索呈放射狀排列，肝細胞核清晰。酒精模型組肝細胞排列紊亂，肝細胞間隙不清，胞質淡染、出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，可見局部變性壞死。給予不同劑量的絞股藍皂苷可以有效抑制這些肝細胞損傷的形態(tài)學改變，呈現(xiàn)一定的劑量依賴的保護作用。

2.3絞股藍皂苷對酒精性肝損傷小鼠肝臟炎癥因子TNF-α和IL-6表達的影響炎癥在肝損傷中發(fā)揮重要作用，為此我們檢測了兩個代表性的炎癥因子TNF-α和IL-6[5-6]。如Fig 2所示，與對照組比較，酒精性肝損傷小鼠肝組織內TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)，不同劑量絞股藍皂苷能夠有效降低酒精引起的TNF-α和IL-6水平的升高(P<0.05)。提示絞股藍皂苷可能通過降低炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌，發(fā)揮保護作用。

2.4絞股藍皂苷對酒精性肝損傷小鼠氧化和抗氧化指標的影響MDA是重要的氧化損傷產物，也是檢測氧化損傷的常用指標[7]。Tab 3結果表明，給予酒精后可以明顯提高肝組織MDA水平(P<0.05)，同時給予絞股藍皂苷能夠有效降低酒精引起的肝臟MDA水平升高(P<0.05)。機體有一整套抗氧化體系能夠清除ROS，減輕氧化應激，其中SOD、CAT和GSH是抗氧化體系的重要組成部分。Tab 3結果表明，酒精性肝損傷能夠明顯降低SOD、CAT、GSH的活性和水平(P<0.05)，而絞股藍皂苷能夠明顯逆轉這些被酒精抑制的抗氧化酶的活性和水平(P<0.05)，并且隨著劑量增加效果更加明顯。提示絞股藍皂苷能夠明顯提高抗氧化酶的活性，減輕酒精引起的氧化損傷。

Tab 2 Effect of gypenosides on ALT, AST, TC and TG in alcohol-treated

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsalcohol model

Tab 3 Effect of gypenosides on MDA, SOD, CAT and GSH in liver of alcohol-treated

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsalcohol model

Fig 1 Effect of gypenosides on pathological changes of liver of alcohol-treated mice(scale bar=200 μm)

A:Control;B:Alcohol;C:Alcohol+50 mg·kg-1GPs;D:Alcohol+100 mg·kg-1GPs;E:C:Alcohol+200 mg·kg-1GPs

Fig 2 Effect of gypenosides on TNF-α(A) and IL-6(B) mRNAexpression in liver of alcohol-treated

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsalcohol model group

2.5絞股藍皂苷對酒精性肝損傷小鼠肝臟Nrf2信號通路的影響Nrf2是抗氧化防御體系上游的重要調控轉錄因子，調控著上百種抗氧化及解毒相關蛋白的轉錄表達[8]。如Fig 3所示，酒精性肝損傷能夠明顯降低Nrf2的蛋白水平(P<0.05)，進一步檢測Nrf2調控的下游代表性抗氧化蛋白表達變化，發(fā)現(xiàn)下游抗氧化蛋白HO-1、GCLC和GCLM的表達水平明顯降低(P<0.05)，表明酒精性肝損傷可以明顯抑制Nrf2信號通路。不同劑量絞股藍皂苷能夠劑量依賴地提高Nrf2蛋白及其調控的下游靶蛋白HO-1、GCLC和GCLM蛋白水平(P<0.05)。提示絞股藍皂苷可以有效激活Nrf2信號通路，提高抗氧化體系能力。

Fig 3 Effect of gypenosides on Nrf2, HO-1, GCLC andGCLM protein levels in liver of alcohol-treated mice

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsalcohol model group

2.6絞股藍皂苷對酒精性肝損傷小鼠肝臟NF-κB核轉位的影響轉錄因子NF-κB是受氧化應激調控的重要轉錄因子，介導了眾多炎癥因子的轉錄表達[9]。NF-κB正常情況下存在胞質中，受到氧化應激等信號激活，會解離掉抑制亞基IкB，功能亞基如p65亞基轉位到細胞核中，發(fā)揮轉錄調節(jié)作用。Fig 4結果表明，酒精性肝損傷可以引起明顯的p65核轉位(P<0.05)，不同劑量絞股藍皂苷干預可以有效抑制p65的核轉位(P<0.05)，并且呈現(xiàn)一定的劑量效應關系。提示絞股藍皂苷可以有效地抑制酒精引起的轉錄因子NF-κB的細胞核轉位，發(fā)揮抗炎作用。

3 討論

絞股藍由于具有調節(jié)三高、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理學作用，加之其毒性小，近年來備受關注。絞股藍中的主要藥理成分為達瑪烷型皂苷類，研究發(fā)現(xiàn)其具有很好的抗氧化作用[3]。酒精性肝損傷機制研究歷史悠久，氧化應激是其中最重要機制之一[10]。氧化應激是各種內外因素引起的ROS產生量超過了抗氧化防御體系所能及時清除的范圍，導致氧化-抗氧化失衡，從而造成氧化損傷。所以我們推測，絞股藍皂苷很可能對酒精性肝損傷有保護作用。我們采用成熟的急性酒精性小鼠肝損傷模型，結果表明，酒精可以引起小鼠肝損傷血清學指標ALT、AST、TC和TG明顯升高，炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平也隨之明顯上升，而絞股藍皂苷干預對這些損傷和炎癥指標有很好的拮抗作用，說明絞股藍皂苷對酒精肝損傷具有很好的保護作用。

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsalcohol model group

為了探討氧化應激在絞股藍皂苷抗酒精肝損傷中的作用，我們進一步檢測了氧化損傷產物及抗氧化酶的改變。結果表明，酒精可以引起肝組織氧化損傷指標MDA增加，同時降低抗氧化酶活性和水平，表明酒精性肝損傷可以引起氧化應激，而絞股藍皂苷干預可以劑量依賴地降低MDA水平，提高SOD、CAT和GSH的活性和水平，提示絞股藍皂苷很可能通過提高抗氧化酶的活性和水平，減輕酒精引起的氧化損傷。絞股藍皂苷如何提高抗氧化酶的活性和水平并不清楚。在這些抗氧化酶上游的調控因子中，Nrf2是非常重要的轉錄因子，在維持機體的抗氧化體系中發(fā)揮著不可或缺的重要作用[11-12]。為此，我們進一步檢測了Nrf2蛋白水平，以及其直接調控下游抗氧化因子HO-1、GCLC和GCLM水平。結果發(fā)現(xiàn)，酒精損傷可以明顯降低Nrf2及其下游的HO-1、GCLC、GCLM蛋白水平，而絞股藍皂苷能夠劑量依賴地提高Nrf2及其下游的抗氧化蛋白水平。說明酒精損傷能夠破壞Nrf2轉錄功能，而絞股藍皂苷能夠通過恢復Nrf2轉錄功能，提高抗氧化蛋白的表達，從而提高抗氧化防御體系能力，發(fā)揮抗酒精性肝氧化損傷作用。

那么氧化應激是通過何種機制誘導炎癥損傷的呢？大量研究表明，NF-κB是能夠被氧化應激激活的重要炎癥轉錄調控因子[13]。正常情況下，NF-κB由多個亞基組成復合物存在于胞質中，只有受到諸如氧化應激等信號刺激時，復合物中的抑制亞基IкB解離掉，釋放出其他功能亞基轉位到細胞核中，發(fā)揮轉錄活性，調控包括TNF-α和IL-6在內的眾多炎癥因子的轉錄和表達[14-15]。為此，我們檢測了代表性的功能亞基p65的核轉位情況，結果發(fā)現(xiàn)，酒精能夠導致p65大量聚集在細胞核中，而絞股藍皂苷能夠明顯抑制p65在細胞核內的聚集，有效抑制NF-κB的核轉位，從而發(fā)揮抗炎癥損傷作用。

綜上所述，本研究證明絞股藍皂苷具有很好的抗酒精性肝氧化損傷作用，其很可能一方面通過激活Nrf2信號通路，提高抗氧化防御體系水平，減輕酒精性肝氧化損傷；另一方面通過抑制NF-κB的核轉位，降低以TNF-α和IL-6為代表的炎癥因子的表達，抑制炎癥反應，從而發(fā)揮對酒精性肝損傷的保護作用。