Lamin A/C在干細胞表觀遺傳藥理學中的調(diào)控作用

趙林平，余細勇

(廣東省分子靶標與臨床藥理學重點實驗室，廣州醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣州 511436)

近年來，干細胞治療為許多難治之癥帶來了希望，干細胞移植在治療心肌梗死[1]、阿爾茨海默病[2]等疾病方面成效明顯。但是對于干細胞體外培養(yǎng)仍面臨以下問題：(1) 在培養(yǎng)過程中，干細胞易凋亡和分化；(2) 在一定的培養(yǎng)條件下，很難對細胞應力進行檢測；細胞微環(huán)境(stem cells niche)也稱干細胞龕，是機體組織儲存干細胞的位置，是一個相對穩(wěn)定的環(huán)境。干細胞微環(huán)境主要包括細胞因子、基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)、力學信號等。力學刺激的產(chǎn)生主要有兩個途徑：內(nèi)源性力學信號和外源性力學信號。內(nèi)源性力學信號是通過細胞骨架蛋白的重組，以及肌動球蛋白的收縮，作用于細胞外基質(zhì)以及基質(zhì)細胞。外源性力學信號是通過機體的物理運動所產(chǎn)生機械拉伸、剪切、收縮等刺激引起細胞效應[3]。因為機械刺激對干細胞命運的調(diào)控至關(guān)重要，所以就如何在體外模擬體內(nèi)相適應的細胞應力模型成為了研究熱點。本文主要綜述微環(huán)境中力學信號對干細胞A型核纖層蛋白(Lamin A/C)的調(diào)節(jié)，以及Lamin A/C的功能變化對染色體修飾、基因表達調(diào)控的影響。

1 核纖層蛋白的結(jié)構(gòu)特征

核纖層由A型核纖層蛋白及B型核纖層蛋白共同組成，處于內(nèi)核膜與染色質(zhì)之間，起著維持細胞核的形態(tài)、保護染色質(zhì)，以及與核纖層連接蛋白共同調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、衰老等作用(Tab 1)。B型核纖層蛋白包括Lamin B1、Lamin B2、Lamin B3，分別由LMNB1和LMNB2編碼。A型核纖層蛋白分為Lamin A(72 ku)和Lamin C(65 ku)，是由同一個基因LMNA轉(zhuǎn)錄、翻譯而來。不同的是，Lamin A與Lamin C 在碳末端有著不同的氨基酸序列，并且Lamin A是由前體PrelaminA(74 ku)經(jīng)剪切修飾而來。在有絲分裂期間，A型Lamins溶解，并在有絲分裂中期游離于核漿內(nèi)，法尼基化B型Lamins則仍保留在核膜上。哺乳動物一般表達B型Lamins，而A型Lamins則主要表達于除胚胎干細胞之外的所有細胞中[4]。

Tab 1 Lamin-associated proteins and function

2 力學刺激對Lamin A/C的調(diào)控

A型Lamins的表達量與組織器官的硬度呈正相關(guān)，隨著組織器官硬度增加，Lamin A/C的表達量也隨之增加，具體表現(xiàn)為股骨表達量最高，軟骨組織其次，最少的為大腦組織[5]。細胞也是如此，Lamin A/C在胚胎干細胞中幾乎不表達[4]。在骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、人造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、心肌細胞等細胞中表達量高[11]，故細胞微環(huán)境對Lamin A/C的調(diào)節(jié)作用。Lamin A/C維持細胞核內(nèi)穩(wěn)定的同時，參與細胞外應力刺激轉(zhuǎn)導的過程。Swift等[11]首次發(fā)現(xiàn)，Lamin A/C參與力學信號的轉(zhuǎn)導及其機制。將MSCs接種于0.3 kPa與40 kPa的聚丙烯酰胺基底的培養(yǎng)皿上，發(fā)現(xiàn)40 kPa組MSCs的Lamin A/C、myosin-IIA表達量明顯高于0.3 kPa組，且Lamin A/C磷酸化水平較0.3 kPa組明顯降低，并闡明力學刺激調(diào)控Lamin A/C表達的機制，表現(xiàn)為Lamin A/C蛋白通過維甲酸信號通路，調(diào)控LMNA的轉(zhuǎn)錄，myosin-IIA通過血清反應因子(serum response factor，SRF)信號通路調(diào)控MYH9轉(zhuǎn)錄。在硬度較大的培養(yǎng)皿中，myosin-IIA磷酸化降低，并通過myosin-IIA的收縮緊張，同時調(diào)控著Lamin A/C的磷酸化和LMNA的轉(zhuǎn)錄。

3 Lamin A/C功能變化與染色體修飾

在細胞核邊緣，常染色體和異染色質(zhì)通過纖層蛋白連接區(qū)域(Lamins-associated domain, LADs)與Lamin A/C相連，Lamin A/C功能的變化影響細胞表觀遺傳的標志。

3.1LaminA/C功能改變與組蛋白甲基化研究表明，LMNA基因突變影響著染色質(zhì)在核內(nèi)的定位與分布。在LaminA(LAΔ50)突變的細胞，細胞核邊緣異染色質(zhì)明顯減少，通過檢測異染色質(zhì)的標志發(fā)現(xiàn)，H3K27me3及EZH2下調(diào)，并伴隨著結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)的標志H4K20me3的上調(diào)[12]。同樣，Gesson等[7]實驗證明，在小鼠Tmpo WT和KO的細胞中，Lamin A/C結(jié)合常染色質(zhì)區(qū)域抑制轉(zhuǎn)錄(H3K9me3、H3K27me3)和激活轉(zhuǎn)錄(H3K4me3、H3K9ac)的組蛋白標記增多，而未結(jié)合區(qū)域則相應減少，卻不影響總體基因表達。相比于異染色質(zhì)，結(jié)合與未結(jié)合區(qū)域表觀遺傳的標記卻未改變，而未結(jié)合區(qū)域基因表達卻上升。表明Lamin A/C以及Lamin A/C-Lap2α復合物在細胞核內(nèi)扮演著表觀遺傳調(diào)控的角色。

3.2LaminA/C功能變化與組蛋白乙酰化LaminA同樣影響著組蛋白乙?；珺arateau等[13]在先天性肌營養(yǎng)不養(yǎng)的患者細胞中發(fā)現(xiàn)LMNA的新突變位點R388P，并將該突變基因轉(zhuǎn)染至C2C12成肌細胞中，可引起組蛋白H3K9乙?；?。已證實SIRT1影響著干細胞衰老[14]，Liu等[15]進一步研究證明，在細胞內(nèi)LaminA與SIRT1直接連接，且LaminA是激活SIRT1去乙?；饔盟匦璧?。在早老病患者(Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS)的細胞中，大量的LaminA被早老蛋白(progerin)替代，SIRT1失去對p53的去乙?；饔?，從而引起細胞衰老。

4 Lamin A/C功能變化與基因表達

LMNA基因突變可引起早老病、擴張型心肌病、埃-德二氏肌營養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy，ED-MD)等疾病，而目前研究尚未發(fā)現(xiàn)B型Lamins突變引起的疾病。早老病是一種致命的人類疾病，患者主要表現(xiàn)為動脈粥樣硬化和血管平滑肌細胞功能的異常。研究獲取早老病患者(LMNA在Gly608Gly位置突變)的成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)其細胞核畸形、Lamin B、Lap2β、異染色質(zhì)的標記H3K9me3、HP1α及HDAC1都發(fā)生相應下調(diào)，同時細胞增殖的標記Ki67也發(fā)生下調(diào)。并且將成纖維細胞用OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC重編程為HGPS-iPSC后，與BJ-iPSC(野生型)對比，在常染色體上有33個基因發(fā)生不同的甲基化，但不引起細胞功能改變。然而，將BJ-iPSC、HGPS-iPSC分別誘導分化為血管平滑肌細胞(smooth muscle cells, SMCs)時，HGPS-iPSC來源的SMCs表現(xiàn)為衰老相關(guān)基因表達上調(diào)，引起細胞早老[16]。Cohen等[17]利用lmna-/-小鼠研究lmna-/-肌成細胞與野生型肌成細胞的蛋白質(zhì)組學，發(fā)現(xiàn)240種蛋白有明顯差異，包括SUN2、Smad2、Smad3、MyoD等，并且肌成細胞的增殖及分化為肌細胞的能力明顯低于正常細胞。

5 Lamin A/C對干細胞命運的調(diào)控

5.1LaminA/C對干細胞增殖的影響Lamin A/C對干細胞增殖的影響是通過直接調(diào)控pRB的表達，并與pRB直接連接，以及通過Lap2α連接pRB抑制其降解，pRB結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子并降低其轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制細胞增殖[9]。

5.2LaminA/C對干細胞分化的影響干細胞具有很強自我復制的能力，并且在一定條件下能分化為多種細胞，然而使干細胞定向分化并用于臨床治療的方法有限。近年來關(guān)于細胞力學調(diào)控干細胞分化的研究逐漸增多。Bergqvist 等[10]發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)蛋白Samp1的表達在iPSCs分化過程中伴隨Lamin A/C的表達而迅速上調(diào)，并與Lamin A/C、emerin相互作用，調(diào)節(jié)iPSCs的分化。Swift等[11]研究證明，在柔軟環(huán)境中，MSCs趨于向脂肪細胞分化，并且證明敲低Lamin A/C能促進向脂肪細胞的分化，而在硬度較大的培養(yǎng)皿中，MSCs則向成骨細胞分化。緊隨其后，Shin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Lamins蛋白水平影響著造血干細胞的分化，通過高表達LaminA、敲低LaminA的表達或加入維甲酸受體抑制劑調(diào)控造血干細胞向紅細胞系、巨核細胞的分化。

5.3LaminA/C與干細胞衰老早老綜合征患者一般是LMNA基因在Gly608Gly位置的突變，導致早老蛋白在細胞內(nèi)的積累，從而影響細胞力學信號的轉(zhuǎn)導、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、重要信號通路的傳導和基因的穩(wěn)定性等，進而引起干細胞衰老。Lavasani等[19]研究證明，早老蛋白在細胞內(nèi)的積累影響干細胞的增殖分化，并發(fā)現(xiàn)WT肌來源干細胞與HGPS干細胞共培養(yǎng)能修復HGPS干細胞的功能，并通過腹腔注射WT肌來源干細胞延長早老綜合征小鼠的壽命。目前，主要運用HGPS多潛能干細胞模型來研究衰老，尋找藥物作用靶點治療早老綜合征[16]。

6 Lamin A/C的細胞力學信號轉(zhuǎn)導通路

細胞骨架不僅承擔著保護細胞內(nèi)細胞器、遺傳物質(zhì)不被物理運動破壞的重要作用，而且還扮演著力學感受器的角色。細胞骨架主要由肌動蛋白、細胞骨架連接蛋白、纖層蛋白等構(gòu)成，當機械刺激作用于細胞膜上的整合素受體，使其活化內(nèi)吞，激活下游通路中的黏著斑激酶(FAK)，或者通過ECM-integrins-talin-actin通路，使YAP/TAZ核轉(zhuǎn)位或者由myosin-IIA緊張拉伸將力學信號傳遞至核膜上，再由Nesprins-SUNs-Lamin A/C復合物傳導至核內(nèi)調(diào)控基因表達[11,20-21]。Lamin A/C在這過程中起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)LMNA基因突變的肌前體細胞，其胞質(zhì)骨架蛋白與細胞核骨架蛋白非正常連接，導致細胞骨架的張力與ECM的張力不一致[22]。

7 靶向Lamin A/C的藥物研究進展

伴隨著細胞表觀遺傳學的研究，涌現(xiàn)出了大批的表觀遺傳學藥物[23]，而針對干細胞Lamin A/C作為藥物靶點的研究較少。目前，絕大多數(shù)藥物研究集中于治療LMNA突變引起的早老病、擴張型心肌病、EDMD等。2014年，Larrieu等[24]發(fā)現(xiàn)小分子化合物Remodelin能通過抑制NAT10，達到改善LMNA突變引起的細胞核畸形、染色質(zhì)松散、DNA損傷。2016年，Egesipe等[25]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能降低HGPS-MSCs中早老蛋白的沉積，進而恢復HGPS-MSCs的功能。

8 問題與展望

作為微環(huán)境中的組成部分，力學信號調(diào)控著干細胞命運，并逐漸被人們重視。然而仍存在著一些問題：首先，機械刺激誘導干細胞定向分化的機制仍不清晰；其次，細胞核質(zhì)內(nèi)存在的Lamin A/C是否參與力學信號轉(zhuǎn)導和參與細胞的表觀遺傳調(diào)控？最后，LaminA、LaminC 在參與干細胞表觀遺傳調(diào)控的過程中是否行使著不同的功能？隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，相信這些問題都會被闡明，干細胞的臨床治療和研究將迎來新紀元。