長鏈非編碼RNA在白內(nèi)障中的研究進展

劉 敏,劉 鑫,云 睿,王陸飛

(吉林大學第二院 眼科，吉林 長春130041)

在人類基因組中，編碼蛋白質(zhì)的序列僅占2%[1]，絕大部分的DNA不具備編碼功能，這些DNA轉(zhuǎn)錄后形成的產(chǎn)物即為非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)。起初發(fā)現(xiàn)時，受研究條件的限制，ncRNA長期被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，被稱作無生物學功能的轉(zhuǎn)錄噪音或基因組中的 “暗物質(zhì)”。ncRNA按照功能可分為管家RNA和調(diào)控RNA,前者包括tRNA和rRNA,調(diào)控RNA根據(jù)轉(zhuǎn)錄本長度又可分為微小RNA (microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA、內(nèi)含子RNA和環(huán)狀RNA等[2,3]。其中，lncRNA是指長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，lncRNA在結(jié)構(gòu)上類似于mRNA(messenger RNA,mRNA) ，經(jīng)過剪接，具有polyA尾巴與啟動子結(jié)構(gòu)，但序列中不存在開放閱讀框，因而不編碼蛋白質(zhì)或編碼功能有限[4,5]。根據(jù)染色體上轉(zhuǎn)錄基因組和蛋白質(zhì)編碼基因的相對位置，可將lncRNA分為7種亞型，即反義型(antisense lncRNA)、基因內(nèi)型(intronic lncRNA)、雙向型(bidirectional lncRNA)、基因間型(intergenic lncRNA)、正義型(sense lncRNA)、增強子型(enhancer lncRNA) 和環(huán)狀型(circRNA)[6]。隨著微陣列和二代測序等敏感且高通量基因組技術(shù)的出現(xiàn)，人們對lncRNA的結(jié)構(gòu)和功能有了新的認識[7]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達調(diào)控，進而影響細胞的增殖、凋亡、活性、免疫應答及氧化應激等生命活動[8,9]。已有研究表明，lncRNA正成為疾病的治療靶點或生物標志物且迅速發(fā)展起來[10-12]。

白內(nèi)障是全球范圍內(nèi)居首位的致盲性眼病。是一種因晶狀體混濁而導致視力下降或視功能損傷的疾病，是晶狀體異常所致的主要疾病[13]。年齡相關性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)，糖尿病性白內(nèi)障(diabetes cataract,DC)和后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsule opacification,PCO)是較常見的白內(nèi)障類型。ARC的形成與晶狀體老化、氧化、Ca2+失衡及晶狀體蛋白的修飾密切相關[14]。DC發(fā)病機制可能是高血糖引起多元醇通路中的醛糖還原酶 (aldose reductase,AR)激活，進而引起晶狀體上皮細胞(lens epithelium cells,LECs)內(nèi)高滲透梯度，致使晶狀體皮質(zhì)纖維水腫、崩解、退化以及晶狀體蛋白合成功能受損,最終形成白內(nèi)障[15]。PCO是由白內(nèi)障摘除術(shù)后，前囊和赤道部殘留的LECs增殖、遷移至后囊膜并且分泌膠原和基底膜樣物質(zhì)引起晶狀體后囊膜渾濁[16]。另外，LECs的凋亡是導致非先天性白內(nèi)障發(fā)生的重要原因。目前臨床上普遍采用的治療方法是晶體摘除及人工晶體植入術(shù)，盡管手術(shù)可以使大多數(shù)患者的視力恢復到較好的狀態(tài)，但畢竟存在手術(shù)風險及術(shù)后并發(fā)癥，因此，研究者們始終致力于對白內(nèi)障發(fā)病機制和預防方法的探索。近年來，越來越多的研究表明，lncRNA在白內(nèi)障的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，與LECs的增殖、遷移、分化、凋亡以及晶體蛋白的修飾密切相關，為尋找預防白內(nèi)障的方法提供了新的策略。

1 lncRNA在年齡相關性白內(nèi)障中的作用

ARC是最常見的白內(nèi)障類型。白內(nèi)障發(fā)病過程中會發(fā)生許多形態(tài)和功能的改變，包括蛋白質(zhì)水解增多、細胞周期的改變、DNA損傷以及LECs生長和分化的改變[17]。

1.1 lncRNA-miRNA軸調(diào)節(jié)晶狀體細胞的功能和凋亡影響白內(nèi)障的進程

lncRNA H19是一種分子量為2.3 kb的lncRNA,位于人類染色體端粒區(qū)11p15.5。miR-675是由lncRNA H19加工修飾形成，其表達受lncRNA H19的正向調(diào)控，H19和miR-675協(xié)同調(diào)控LECs的功能[18]。 Liu等[19]通過lncRNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在透明和核性白內(nèi)障晶狀體中有63個lncRNA差異表達，包括37個下調(diào)的lncRNA和26個上調(diào)的lncRNA。其中，lncRNA H19在核性白內(nèi)障晶狀體中表達量最高，這一結(jié)果促使他們進一步研究lncRNA H19在核性白內(nèi)障發(fā)病機制中的潛在作用。他們發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA H19的表達水平后，LECs的細胞活力降低、遷移數(shù)量減少、凋亡加速。此外，α晶體蛋白(αA-crystallin,CRYAA)是miR-675-5p的作用靶點，即miR-675-5p的表達水平受lncRNA H19的調(diào)控，同時也調(diào)控CRYAA的表達，從而參與LECs的凋亡、增殖和遷移過程。通過以上實驗表明lncRNA H19可通過miR-675介導的CRYAA的表達調(diào)控LECs凋亡、增殖和遷移，在白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

牛磺酸上調(diào)基因1(long non-coding RNA taurine upregulated gene 1,lncRNA TUG1)是一種分子量為7.1 kb的lncRNA,位于人類染色體22q12.2上，最初在牛磺酸處理過的視網(wǎng)膜中被發(fā)現(xiàn)上調(diào)[20]。lncRNA TUG1和視網(wǎng)膜的發(fā)育密切相關，敲除TUG1后，視網(wǎng)膜上發(fā)育中的棒狀光感受器在向外核層遷移、錐體特異性標記物的異位表達、細胞凋亡增加等方面都會表現(xiàn)出缺陷[21]。Li[22]等在紫外線照射的LECs模型以及白內(nèi)障術(shù)中獲得的晶狀體前囊膜中發(fā)現(xiàn)，LECs中的lncRNA TUG1表達上調(diào)， miR-421的表達量則明顯降低，進一步的研究表明lncRNA TUG1可通過miR-421/caspase-3軸調(diào)控晶狀體蛋白的表達以及LECs的凋亡，LECs的凋亡是白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的早期病變。

細胞焦亡是由炎性小體觸發(fā)的一種促炎細胞死亡形式，炎性小體是一種多蛋白復合物，聚集在細胞溶膠中激活半胱天冬氨酸酶1(caspase-1)[23]。Jin等[23]的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA重疊轉(zhuǎn)錄物1(KCNQ1 overlapping transcritp 1,KCNQ1OT1)可能作為內(nèi)源性miRNA海綿結(jié)合miR-214并調(diào)控其功能。另外，caspase-1是miR-214的下游靶點，其表達受miR-214的調(diào)控。綜上，lncRNA KCNQ1OT1可能通過miR-214/caspase-1軸促進LECs的細胞焦亡，進而參與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程。

1.2 lncRNA-miRNA-蛋白激酶形成反饋回路來調(diào)節(jié)LECs功能和凋亡影響白內(nèi)障進程

心肌梗死相關轉(zhuǎn)錄物(myocardial infarc-tion associated transcript,MIAT)是一種lncRNA,最初認為和心肌梗死有關[24]，近期的研究表明，lncRNA MIAT參內(nèi)皮細胞功能的調(diào)控以及糖尿病微血管功能障礙[25]。有關白內(nèi)障發(fā)生機制的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIAT在白內(nèi)障患者的全血和房水中表達上調(diào)具有特異性，提示其可能是白內(nèi)障的特異性生物標志物；同時其表達水平的升高有可能成為抗氧化應激的補償反應[26]。競爭性內(nèi)源性RNA (Competing endogenous RNA,ceRNA)是許多疾病(包括癌癥)的驅(qū)動因素，又稱miRNA誘餌或miRNA海綿，通過與miRNA識別元件堿基配對，與RNA轉(zhuǎn)錄本競爭結(jié)合miRNA，從而降低靶向mRNA可用的miRNA數(shù)量。ceRNA包含不同種類的RNA：mRNA、lncRNA 、偽基因或環(huán)狀RNA，它們相互競爭與共享的miRNA結(jié)合而相互作用和共同調(diào)控[27-32]。研究表明lncRNA MIAT是一種ceRNA,可作為miRNA-150-5p的海綿調(diào)控其和靶基因的有效結(jié)合，miRNA-150-5p也可直接控制LECs中l(wèi)ncRNA MIAT的表達水平。此外，研究發(fā)現(xiàn)AKT作為miRNA -150-5p的作用靶點，其表達受miRNA -150-5p的調(diào)控[26]。他們還發(fā)現(xiàn)lncRNA MIAT下調(diào)降低LECs的增殖和生存能力，而外源性AKT激活劑可逆轉(zhuǎn)lncRNA MIAT的作用，表明lncRNA MIAT、AKT串擾參與LECs功能調(diào)控。綜上表明，lncRNA MIAT、miRNA-150-5p和AKT形成反饋回路調(diào)控LECs的功能，進而調(diào)控白內(nèi)障的發(fā)病過程。

2 lncRNA 在糖尿病性白內(nèi)障中的作用

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關記錄1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一種高度保守的lncRNA，在高糖處理的晶狀體細胞系RF/6A和糖尿病患者房水樣品中均顯著上調(diào)[33]。Gong[34]等的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1和SP1在DC前晶狀體囊膜組織和高糖處理過的LECs中表達上調(diào)，且高糖可通過SP1結(jié)合lncRNA MALAT1啟動子區(qū)域誘導MALAT1上調(diào)，高糖處理可增強凋亡相關蛋白的表達，使SRA01/04細胞活力降低，也可誘導氧化應激，還可使P38的表達顯著升高。而下調(diào)lncRNA MALAT1的表達，可逆轉(zhuǎn)高糖引起的效應，證實了lncRNA MALAT1在LECs的凋亡和氧化應激中發(fā)揮作用。此外，lncRNA MALAT1可通過激活P38/MAPK通路促進LECs的凋亡和氧化應激，lncRNA MALAT1可能成為DC的潛在的治療靶點。

Hauser等[35]通過以H2O2誘導LECs氧化應激，發(fā)現(xiàn)H2O2的濃度升高會下調(diào)lncRNA LOXL1-AS1表達，表明lncRNA LOXL1-AS1可能在LECs的氧化應激中也發(fā)揮了關鍵作用。

3 lncRNA在后發(fā)性白內(nèi)障中的作用

lncRNA可以通過TGF過NA障中MAD通路調(diào)控LECs增殖和EMT

白內(nèi)障術(shù)后后囊膜渾濁又稱為PCO，是白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥[36]，其發(fā)病率為成人30%- 50%，兒童為100%，給全世界的患者帶來了沉重的負擔，也引起了外科醫(yī)生的關注[37]。PCO的主要原因是晶狀體上皮細胞的增殖、遷移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymaltransition,EMT)[38]。EMT是一種生物學過程，即極化的上皮細胞發(fā)生多種生化變化，遷移能力增強、侵襲性增強、抗凋亡能力增強而具有了間充質(zhì)細胞的表型[39]。已有研究表明轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factorite>

HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR) 是一種具有反式作用的lncRNA,定位于人類染色體12q13.13的HOXC家族中，以反式轉(zhuǎn)錄方式調(diào)控基因的表達[41]。相關研究證實TGF-β2在SRA01/04細胞中可以引起EMT。同時，TGF可上調(diào)SRA01/04細胞的lncRNA HOTAIR表達以及增加磷酸化和非磷酸化蛋白(Smad2和Smad3)的水平，HOTAIR的下調(diào)可使TGF引起的間質(zhì)化結(jié)果得到扭轉(zhuǎn)。表明lncRNA HOTAIR可以通過TGF-HOTAIR通路調(diào)節(jié)EMT[9]。此外，Zhang等[42]也以TGF)IN誘導LECs發(fā)生EMT,構(gòu)建白內(nèi)障細胞模型。發(fā)現(xiàn)上調(diào)的lncRNA325個，下調(diào)的lncRNA450個，說明了下調(diào)的lncRNA 比上調(diào)的lncRNA更為常見。而后，他們對差異表達的lncRNA進行了靶預測，發(fā)現(xiàn)565個lncRNA具有cis靶基因，213個lncRNA具有trans基因。他們選取了前4位的lncRNA(上調(diào)的lnc-PMEPA1-2∶1 ，ENST00000597865和下調(diào)的 NR-033931,ENST00000582120)進行分析，發(fā)現(xiàn)他們可以通過相關通路調(diào)控EMT的進程，表明lncRNA在后囊膜渾濁的形成中發(fā)揮潛在作用，為白內(nèi)障的研究和防治提供了新思路。

Chen[43]等以TGF-β誘導SRA01/04細胞構(gòu)建PCO細胞模型，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA KCNQ1OT1以及SMAD4在PCO患者晶體后囊膜組織樣本和白內(nèi)障模型中表達上調(diào)，且經(jīng)分析lncRNA KCNQ1OT1和SMAD4呈正相關。下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1的表達，可顯著降低細胞的增殖能力，逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導引起的EMT、纖連蛋白的增加以及鈣黏蛋白的降低等效應。另外，上調(diào)和下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1可分別上調(diào)和下調(diào)SMAD4的表達，表明lncRNA KCNQ1OT1通過SMAD4信號通路調(diào)控SRA01/04細胞的增殖和EMT。

4 lncRNA參與晶狀體的發(fā)育過程中的作用

晶狀體由LECs和晶狀體纖維細胞組成，在晶狀體發(fā)育過程中，赤道部LECs不斷向晶狀體內(nèi)延伸，細胞器逐漸降解分化為纖維細胞，從而維持晶狀體的透光性，實現(xiàn)晶狀體的光反射和光調(diào)節(jié)功能[44]。晶狀體發(fā)育過程的異常，也將導致白內(nèi)障的發(fā)生。

Chen[45]等通過對新生和正常8周齡小鼠的6種組織(即角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜、RPE、脈絡膜和鞏膜)的研究和分析，表明lncRNA的表達在小鼠新生至成熟的過程中發(fā)生明顯的變化，并且具有明顯的組織特異性。另外，還研究了NONCODE網(wǎng)站上列出的人和小鼠lnc轉(zhuǎn)錄本之間的同源性，在19,315個lncRNA中，只有651個lncRNA與人類lncRNA保守，說明了這些lncRNA在促進人類眼的發(fā)育方面可能具有重要作用。Hoang等[46]通過對新生小鼠LECs和纖維細胞進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)86個lncRNA差異表達，另外根據(jù)基因本體論分析顯示，LECs上調(diào)的基因在細胞外基質(zhì)生成、細胞分裂、遷移、蛋白激酶活性、生長因子結(jié)合、鈣離子結(jié)合等方面均得到富集。在纖維細胞中上調(diào)的基因被富集成蛋白體復合物、展開蛋白反應、磷酸酶活性和泛素結(jié)合。同時，也強調(diào)了幾個重要信號通路比如晶狀體結(jié)構(gòu)成分、細胞器丟失和去核等所涉及的差異表達基因，為晶狀體發(fā)育和晶狀體纖維分化提供了見解。

細胞自噬是指發(fā)生在真核細胞內(nèi)一系列保守的內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程，它通過形成自噬體或蛋白酶體，將細胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)及其細胞器進行吞噬、降解，必要時再循環(huán)產(chǎn)生必須的蛋白質(zhì)原料，從而保證細胞在不利的條件下獲得生存優(yōu)勢[47]。在晶狀體的發(fā)育過程中，初級的晶狀體纖維細胞分化成熟，通過使細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等膜性細胞器退化降解來形成無細胞器區(qū)，來達到光學的透光性[48],自噬成為晶狀體細胞器降解過程中必不可少的一環(huán)，自噬功能的異常，將影響晶狀體的透明性，進而發(fā)展為先天性白內(nèi)障。Qiu等[49]的研究發(fā)現(xiàn)在體外晶狀體誘導分化過程中，lncRNA ALB在分化晶狀體中高度表達，其表達模式與在人類胚胎晶狀體中的表達模式一致。研究證實lncRNA ALB的下調(diào)可以降低LECs的自噬活性，表明lncRNA ALB在晶狀體發(fā)育過程中對細胞器的降解具有潛在作用。