針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞自噬影響的研究概況

孫曉偉，高營，王新宇，劉婷婷，潘婷婷，劉丹，劉勇，陳英華，金弘，李洪濤*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦缺血再灌注損傷[1](Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是急性腦梗死再通后常見的病理過程，CIRI后會(huì)引發(fā)一系列的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致大量神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡。自噬(autophagy)作為新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式，對(duì)于腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的“存活”與“毀滅”意義重大。一方面適度自噬可幫助細(xì)胞清除受損的細(xì)胞器和異常折疊蛋白，促進(jìn)自體修復(fù)，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用；另一方面過度的自噬與凋亡信號(hào)存在交互作用，可誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展，從而加重神經(jīng)細(xì)胞損傷。因此，明確CIRI后神經(jīng)細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制，通過某些干預(yù)手段，促使CIRI后神經(jīng)細(xì)胞自噬的適度激活，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的自體修復(fù)，有望成為CIRI后神經(jīng)功能重塑的新的治療思路。

針刺作為中醫(yī)學(xué)的特色療法，在CIRI防治過程中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其穩(wěn)定和理想的療效，安全方便的操作已受到了醫(yī)學(xué)界的公認(rèn)和肯定。對(duì)機(jī)體可發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多水平、多途徑的調(diào)節(jié)作用。越來越多的研究表明針刺對(duì)CIRI后誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬有良性的調(diào)節(jié)作用。本文就國內(nèi)外關(guān)于針刺對(duì)CIRI誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬影響的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，以期為臨床應(yīng)用針刺防治CIRI提供全新的科學(xué)依據(jù)。

1 自噬概述

自噬[2]又稱細(xì)胞的“自我消化”，是一種細(xì)胞經(jīng)由溶酶體途徑參與降解胞漿內(nèi)受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的分解代謝過程，對(duì)維持細(xì)胞的生存、分化、生長(zhǎng)以及穩(wěn)定具有重要作用[3]。根據(jù)自噬的轉(zhuǎn)運(yùn)方式可分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬[4]；根據(jù)自噬對(duì)降解底物的選擇性可分為選擇性自噬(線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、過氧化物酶體自噬、核糖體自噬和脂類自噬)以及非選擇性自噬[5]。

目前常采用透射電鏡、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associatedprotein 1 light chain 3，LC3/Atg8)turnover、綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的抗降解性、P62蛋白、mRFP-GFP-LC3活細(xì)胞成像和流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)自噬體及其標(biāo)志蛋白[6]。透射電鏡是觀察自噬最直接、最經(jīng)典的方法，能特征性地表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中有自噬體和自噬溶酶體出現(xiàn)[7]。自噬[8]是一個(gè)由自噬相關(guān)蛋白精密調(diào)控的、動(dòng)態(tài)的生物進(jìn)程，基本過程包括誘導(dǎo)、隔離膜生成與延伸、自噬體的形成與成熟、與溶酶體融合、自噬溶酶體的降解以及小分子循環(huán)再利用等步驟，這一過程對(duì)細(xì)胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建起關(guān)鍵作用。

2 自噬與腦缺血再灌注損傷

近年來，大量體外或在體的實(shí)驗(yàn)證明自噬參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程，并且影響神經(jīng)細(xì)胞的生存和死亡。Sheng等[9]分別通過自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素及自噬抑制劑3-MA對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞引起的缺血性腦損傷大鼠模型進(jìn)行預(yù)處理和預(yù)適應(yīng)后，觀察到缺血大鼠模型的腦梗塞面積、腦水腫程度以及神經(jīng)功能缺陷三個(gè)方面均有不同程度減輕，進(jìn)而說明自噬對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。Carloni等[10]研究也發(fā)現(xiàn)在缺血缺氧誘導(dǎo)的腦損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平增加，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素進(jìn)一步上調(diào)自噬水平后可減少壞死性細(xì)胞死亡，減輕腦損傷。但也有實(shí)驗(yàn)證明，過度的自噬可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡。CHEN等[11]發(fā)現(xiàn)，在特定的環(huán)境下，自噬不僅阻止細(xì)胞死亡同樣也調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，如果自噬破壞細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞器超過一定的閾值，自噬性細(xì)胞死亡就會(huì)發(fā)生。大鼠進(jìn)行永久大腦動(dòng)脈栓塞造模，可引起自噬的過度激活，導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，加重了腦損傷，分別用3-MA抑制自噬和干擾Beclin 1均可減輕大鼠的神經(jīng)元死亡。因此，在腦缺血/再灌注不同時(shí)間窗，通過何種途徑啟動(dòng)自噬，發(fā)揮其清除作用，又通過何種途徑關(guān)閉自噬來防止其過度激活，決定著自噬是發(fā)揮保護(hù)抑或損傷作用，對(duì)其相關(guān)的分子機(jī)制的研究有望為今后該病的防治提供重要的干預(yù)靶點(diǎn)[12]。

3 針刺對(duì)CIRI神經(jīng)細(xì)胞自噬影響的研究概況

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外在針刺防治CIRI的臨床機(jī)制與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，從宏觀到微觀、從系統(tǒng)水平到基因水平均有所涉及。許多研究資料證實(shí)[13-15],針刺可增強(qiáng)腦組織超氧化物歧化酶活性；對(duì)抗自由基損傷；抑制興奮性氨基酸釋放；減輕免疫炎性反應(yīng)；降低Ca2+超載；改善腦部血液循環(huán)、增加血流量、促進(jìn)腦微血管功能重建及血腦屏障修復(fù)；抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡；促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子的激活與神經(jīng)干細(xì)胞增殖；調(diào)控細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。針刺拮抗CIRI的機(jī)制是多方面、多層次的，針刺幾乎參與了CIRI的所有病理變化過程，而CIRI后的各種分子學(xué)改變是相互影響、相互制約的，針刺正是通過調(diào)節(jié)這樣一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的系統(tǒng)而達(dá)到減輕CIRI、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。近年來隨著對(duì)自噬研究的不斷深入，大量的實(shí)驗(yàn)研究亦表明[16-17]，針刺對(duì)CIRI誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬有一定的調(diào)控作用。

3.1 針刺對(duì)CIRI神經(jīng)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

自噬有著相當(dāng)復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，其中Atg6(Beclin-1)、Atg8(LC3)和P62蛋白是自噬發(fā)生必不可少的分子[18]。LC3是酵母自噬相關(guān)基因Atg8的哺乳動(dòng)物同源類似物，存在兩種可以互相轉(zhuǎn)換的形式,分別為L(zhǎng)C3-Ⅱ和LC3-I[19]。LC3-Ⅱ被認(rèn)為是自噬體形成的標(biāo)志，與自噬體的形成有著密切的關(guān)系，隨著自噬體膜的不斷增多，LC3-Ⅱ的數(shù)量或LC3-Ⅱ/I的比例與自噬體的數(shù)量呈正比，在一定程度上反應(yīng)了自噬的活性[20]。缺血性卒中后3 h，RT-PCR和Western Blot等技術(shù)便可檢測(cè)到LC3的表達(dá)[21]。Beclin-1作為酵母Atg6的同源物，與三類磷酸肌醇3-激酶(class III phosphoinositide 3-kinase，PI3K)和Atg14L等結(jié)合形成復(fù)合體，調(diào)控自噬前體和自噬體形成[22]。Beclin-1在大鼠腦內(nèi)如皮質(zhì)、海馬、小腦等均有表達(dá)，免疫組化等方法在腦組織缺血后6 h即發(fā)現(xiàn)Beclin-1陽性細(xì)胞，24 h達(dá)高峰，至少持續(xù)48 h[23]。干擾Beclin-1表達(dá)可降低腦缺血誘導(dǎo)的自噬激活[24]。P62蛋白是一種支架蛋白，作為一種自噬特異性底物，偶聯(lián)于LC3，通過自噬小體與溶酶體完成蛋白的降解[25]，在體內(nèi)P62蛋白與自噬水平呈負(fù)相關(guān)，在大鼠局灶性腦缺血模型建立后6 h，該蛋白表達(dá)下調(diào)，持續(xù)至少48 h，在缺血后24 h達(dá)最低點(diǎn)。徐勤紅等[26]通過隨機(jī)對(duì)照的臨床研究，觀察“通督調(diào)神針法”與常規(guī)針刺治療急性腦梗死患者的臨床療效差異及其與自噬的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“通督調(diào)神針法能明顯提高急性腦梗死患者血清中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)自噬溶酶體形成，促使細(xì)胞自噬的大量啟動(dòng)，最終減輕CIRI，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，從而提高患者生活質(zhì)量、智力水平及改善神經(jīng)功能。馮曉東等[27]通過制備MCAO/R大鼠模型，觀察電針神庭、百會(huì)穴對(duì)MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、腦梗死體積以及Beclin-1表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針神庭、百會(huì)穴可使MCAO/R大鼠逃離水迷宮的潛伏期明顯縮短，可明顯改善其學(xué)習(xí)記憶障礙，同時(shí)自噬相關(guān)基因Beclin-1與其蛋白表達(dá)均上調(diào)，提示電針對(duì)自噬水平的提高可能是其改善卒中后認(rèn)知功能的機(jī)制之一。Ting Z等[28]通過血管閉塞建立腦缺血再灌注大鼠模型，電針百會(huì)、神門和足三里穴后，通過Western印跡法測(cè)量自噬相關(guān)蛋白LC3，mTOR和Beclin-1的表達(dá)情況以及TTC染色評(píng)估大鼠腦梗死面積，發(fā)現(xiàn)給予電針刺激后的大鼠的LC3和Beclin-1水平降低，mTOR水平升高。由此證明電針干預(yù)不僅可以減輕腦缺血引起的氧化和炎癥損傷，同時(shí)可以通過抑制神經(jīng)元的過度自噬改善CIRI。Shu S等[29]采用隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，給予腦缺血再灌注模型電針刺激，在不同時(shí)間下測(cè)量大鼠的神經(jīng)功能缺損和腦梗死體積以評(píng)估改善效果，同時(shí)檢測(cè)Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)以探討電針對(duì)自噬的影響，結(jié)果顯示電針可顯著降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積，電針組中Beclin-1，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例顯著降低，說明自噬可能是參與電針腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一。

3.2 從mTOR通路研究針刺對(duì)CIRI神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響

自噬的調(diào)節(jié)除了由多種分子參與外，還涉及了多條信號(hào)通路[30]，其中雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是調(diào)節(jié)自噬的最主要信號(hào)通路。mTOR的上游涉及到PI3K/Akt、MAPK(ERK、JNK、p38MAPK)、AMPK(LKB1-AMPK)等多條信號(hào)通路。哺乳類動(dòng)物體內(nèi)唯一的mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，按功能可分為mTORC1和mTORC2，其中mTORC1主要調(diào)節(jié)自噬和蛋白質(zhì)合成[31]。研究表明[32]，缺血缺氧刺激，通過ATP/AMP比值的降低來調(diào)控AMPK通路，抑制mTORC1活性進(jìn)而誘導(dǎo)自噬。Carloni等[33]對(duì)SD大鼠缺血缺氧性腦損傷前側(cè)腦室注射自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、PI3K抑制劑渥曼青霉素、自噬抑制劑3-MA后，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt-mTOR自噬信號(hào)通路參與了缺血缺氧造成的損傷。Ⅲ型PI3K是細(xì)胞內(nèi)一種能通過催化底物形成PI3P的關(guān)鍵酶，誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞的凋亡和壞死，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。有研究者[34]通過給予缺血缺氧腦病大鼠的電針干預(yù)治療，觀察到電針對(duì)PI3K/Ak信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及下游靶蛋白mTOR具有調(diào)控作用，證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與缺血缺氧腦病的保護(hù)機(jī)制密切相關(guān)。何堅(jiān)等[35]通過電針針刺MCAO/R模型大鼠曲池、足三里，并在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，電針組mTORC1的表達(dá)比模型組提高，LC3-Ⅱ/LC3-I的比率卻比模型組低，提示電針可抑制自噬溶酶體數(shù)量，說明電針可能通過mTORC1-ULK復(fù)合體-Beclin1通路抑制過度激活的細(xì)胞自噬，從而保護(hù)神經(jīng)元。

3.3 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑研究針刺對(duì)CIRI神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)對(duì)膜蛋白的合成、初始翻譯的修飾以及蛋白的正確折疊和分泌具有關(guān)鍵作用。腦缺血再灌注損傷后會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，使得蛋白折疊受阻，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白蓄積于內(nèi)，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)[36]，激活未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response, UPR)，增加伴侶分子的合成及錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的降解來維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)平衡。當(dāng)ERS激活時(shí)會(huì)進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞自噬，以清除錯(cuò)誤折疊蛋白，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的平衡又反過來抑制ERS，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存。由此，ERS與自噬的適度激活形成了機(jī)體內(nèi)適應(yīng)性、保護(hù)性的交互作用[37]。UPR是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的重要信號(hào)通路。UPR信號(hào)通路被激活后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊蛋白使得葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein78/Binding immuno-globulin protein，GRP78/Bip)釋放PERK/elF2α、Ire1/TRAF2、ATF6α，共同調(diào)控下游CHOP，而CHOP轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，最終通過誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)來影響自噬。舒適[38]在MCAO/R大鼠模型中，通過動(dòng)態(tài)觀察針刺水溝穴對(duì)CIRI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)自噬性程序性細(xì)胞死亡的影響，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PERK/el F2α、Ire1/TRAF2、ATF6α的分子作用途徑深入闡釋CIRI后自噬性程序性細(xì)胞死亡的作用機(jī)制以及針刺水溝穴減輕CIRI可能物質(zhì)基礎(chǔ)與有效作用靶點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針?biāo)疁涎▽?duì)大鼠CIRI的治療作用機(jī)制可能與抑制Beclin-1、LC3表達(dá)，下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平密切相關(guān)；電針?biāo)疁涎赡芡ㄟ^上調(diào)GRP78，干預(yù)UPR中PERK/e IF2α和IRE1通路，抑制CHOP表達(dá)水平來影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP通路調(diào)控Beclin-1表達(dá)，抑制過度自噬是針刺水溝穴減輕CIRI的重要環(huán)節(jié)；并由此推測(cè)針刺減輕發(fā)生CIRI可能與啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控CHOP來誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過程密切相關(guān)。

4 總結(jié)與展望

總之，細(xì)胞自噬是一把“雙刃劍”，可廣泛參與CIRI復(fù)雜的病理生理進(jìn)程，影響細(xì)胞的存活與死亡。一方面適度自噬可幫助細(xì)胞恢復(fù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞自體修復(fù)，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用；另一方面過度自噬又可誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡、促進(jìn)凋亡的發(fā)生與發(fā)展，從而加重神經(jīng)細(xì)胞損傷，因此，探究CIRI后神經(jīng)細(xì)胞自噬及其相關(guān)機(jī)制，具有重要的研究?jī)r(jià)值和科學(xué)研究意義。

針刺對(duì)CIRI后神經(jīng)細(xì)胞自噬的研究剛剛起步，雖然我們已經(jīng)對(duì)國內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行了全面的檢索，但有關(guān)此方面研究的文章總數(shù)還是相對(duì)較少，穴位選擇、針灸干預(yù)措施等均缺乏重復(fù)測(cè)試，且多數(shù)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，僅有1篇臨床研究。同時(shí)許多研究多針對(duì)CIRI后自噬相關(guān)蛋白展開研究，對(duì)自噬的通路、選擇性自噬(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、線粒體自噬、過氧化物酶體自噬)等研究相對(duì)較少。另外，采用的研究方法相對(duì)單一，多為透射電鏡、Western Blot和RT-PCR等檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上尚有很多不足，如缺乏特異性抑制劑、慢病毒干擾以及相關(guān)基因敲除等作為特異性對(duì)照；同時(shí)大多研究沒有設(shè)立假針刺組和非穴位組等。相信隨著針刺調(diào)控CIRI后細(xì)胞自噬嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范和更加細(xì)微深入的系統(tǒng)研究，針刺對(duì)CIRI后神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制會(huì)更加明朗化，從而為缺血性腦卒中及腦缺血再灌注損傷的防治取得突破性的進(jìn)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。