市售瓶裝礦泉水微生物的檢測與分析

許曉云，陳 倩，劉 琦，李作美

（安徽省蚌埠學院食品與生物工程學院，安徽蚌埠 233000）

水是生命之源，人類的生產(chǎn)活動離不開水，水質安全是人類健康的第一要素。隨著生活水平的不斷提高，人們對飲用水的安全問題日益重視，而瓶裝礦泉水飲用方便、易于攜帶，因此已成為人們日常生活中不可或缺的飲品。若瓶裝礦泉水中微生物含量超標，輕則導致人體患腸道疾病，并引起嘔吐、腹瀉等癥狀，重則可致人死亡，尤其對已患病的老年人和嬰幼兒危害最大[1]。我國飲用水的相關標準主要有《瓶（桶） 裝飲用純凈水衛(wèi)生標準》 （GB 17324—2003）、 《生活飲用水衛(wèi)生標準》 （GB 5749—2006）、 《飲用天然礦泉水》 （GB 8537—2008） 和《食品安全國家標準包裝飲用水》 （GB 19298—2014）。其中，《飲用天然礦泉水》2008版本要求銅綠假單胞菌不得檢出[2]，《食品安全國家標準包裝飲用水》 （GB 19298—2014） 不再保留菌落總數(shù)、霉菌和酵母計數(shù)、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及志賀氏菌指標，僅保留大腸菌群指標，增加了條件致病菌——銅綠假單胞菌指標，二者均不可檢出[3]。

1 細菌菌落總數(shù)的測定

水樣中菌落總數(shù)是指1 mL水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上于有氧條件下培養(yǎng)48 h后所含細菌菌落的總數(shù)。通過菌落總數(shù)可判斷生產(chǎn)的衛(wèi)生環(huán)境和瓶裝飲用水的質量，預測飲用水的貯存期限。菌落總數(shù)多少雖然不能說明致病菌的多少，但菌落總數(shù)超標會增大致病菌超標的概率，在一定程度上也就增加了患病的幾率[4]。

細菌菌落總數(shù)的檢測方法有平皿計數(shù)法、涂布平板法和酶底物法。但由于細菌種類繁多，每種菌的生長條件和速率都存在差異，所以計算出的細菌菌落總數(shù)只是一個近似值。

1.1 平皿計數(shù)法

平皿計數(shù)法所用的培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，將1 mL的水樣與冷卻至45℃以下的未凝固的營養(yǎng)瓊脂混勻于培養(yǎng)皿中，待凝固后翻轉培養(yǎng)皿，放進36℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出計數(shù)[5]。營養(yǎng)瓊脂的澆灌量需一致，菌落總數(shù)不在30～300 CFU/mL范圍的樣品要重新制作（增加水樣或稀釋水樣）。

1.2 涂布平板法

涂布平板法所用的培養(yǎng)基可以為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，也可以為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。將配制好且滅菌后的培養(yǎng)基趁熱倒入無菌平板中，待凝固后再吸取0.1 mL水樣滴于培養(yǎng)皿上，用涂布棒涂均勻，平放在桌上靜置20～30 min，使菌液完全滲入，然后將平板倒轉，于37℃下恒溫培養(yǎng)48 h計數(shù)。涂布棒在涂水樣時可能會將水樣里的細菌帶出，為使試驗數(shù)據(jù)更加準確，徐維昌等人[6]為每份水樣都準備了3份空白培養(yǎng)基，把水樣滴于1號培養(yǎng)基涂布后，用涂布棒于2號培養(yǎng)基上再涂1次，最后在3號培養(yǎng)基上涂1次，3份培養(yǎng)基上長出的菌落總數(shù)之和即為此份水樣中所含的細菌總數(shù)。

1.3 酶底物法

近年來出現(xiàn)了一種測定菌落總數(shù)的新方法，即酶底物法。劉玉紅等人[7]通過這種方法清晰、準確、快速地讀出了細菌菌落的總數(shù)。此法是將1 mL水樣和9 mL IDEXX復合酶底物技術TM酶混勻于愛德士Simplate圓盤中，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后，將樣品圓盤在黑暗處于波長365 nm處的紫外燈下照射，細菌的菌落可產(chǎn)生熒光，最終根據(jù)MPN表（菌群最大近數(shù)）計出菌落的總數(shù)。

魯巍等人[8]認為，由于飲用水中的貧營養(yǎng)環(huán)境不同于傳統(tǒng)培養(yǎng)基，所以大多數(shù)在顯微鏡下觀察到的細菌不能在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中生長，因此造成所得結果比實際結果低。國外常用AODC法和Baclight染色直接計數(shù)法對總細菌進行計數(shù)，用DVC法和HPC法對活細菌進行計數(shù)。

2 大腸菌群數(shù)的測定

大腸菌群是指在一定的培養(yǎng)條件下（36±1℃，24～48 h），能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。在人畜糞便污染的水中可被大量檢出，在富營養(yǎng)化的自然水體中也可檢出，因此是評價瓶裝飲用純凈水衛(wèi)生標準的重要微生物指標之一。大腸菌群的檢測方法有多管發(fā)酵法、濾膜法和酶底物法。

2.1 多管發(fā)酵法

多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸菌群的發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特征來檢測水樣中大腸菌群的方法。多管發(fā)酵法包括乳糖蛋白胨發(fā)酵法和乳糖膽鹽發(fā)酵法[9]。乳糖蛋白胨發(fā)酵法所用的培養(yǎng)基有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基和伊紅美藍平板培養(yǎng)基。取1 mL水樣接種于乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，放置一杜氏小管，于36.5℃條件下培養(yǎng)24～48 h。變黃且產(chǎn)氣的再接種于伊紅美藍平板培養(yǎng)基上于36.5℃條件下培養(yǎng)24 h，對可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢，挑取符合特征的菌落用乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基進行確證試驗。根據(jù)陽性管數(shù)查表得出MPN數(shù)值，結果以MPN/100 mL作報告。

乳糖膽鹽發(fā)酵法所用的培養(yǎng)基有乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基和亮綠乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基。取1 mL水樣接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管中，放置一杜氏小管，于36.5℃條件下培養(yǎng)24～48 h。取樣接種于亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液中于36.5℃下培養(yǎng)24 h，同樣放一杜氏小管，如有產(chǎn)氣確定為陽性，根據(jù)陽性管數(shù)查表得出MPN數(shù)值，結果以MPN/100 mL報告。

2.2 濾膜法

濾膜法分為國標濾膜法和酶底物濾膜法[10]。濾膜法是0.45 μm的濾膜經(jīng)過抽濾一定量的水樣（100～250 mL），而使得細菌被截留在濾膜上，隨后通過培養(yǎng)、計數(shù)和鑒定被截留菌的方法。

2.2.1 國標濾膜法

國標濾膜法的培養(yǎng)基為品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基和乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基。將有細菌的一面貼在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取顏色為紫紅色的菌落進行革蘭氏染色，凡為革蘭氏陰性的菌群都需接種于乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基進行復發(fā)酵試驗，再于37℃條件下培養(yǎng)24 h，放置一杜氏小管，若培養(yǎng)液變黃且產(chǎn)氣則判定為大腸菌群陽性，結果以CFU/100 mL表示。

2.2.2 酶底物濾膜法

酶底物濾膜法的培養(yǎng)基為酶底物技術的選擇性培養(yǎng)基。將有細菌的一面貼在酶底物培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，有藍綠色的菌群即證明有大腸菌群，結果以CFU/100 mL表示。

2.3 酶底物法

酶底物法的試劑是ONPG和MUG 2種營養(yǎng)指示劑[11]。大腸菌群細菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶和大腸埃希氏菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶能分別分解2種指示劑，而使得營養(yǎng)液呈黃色，并且在波長366 nm的紫外燈下產(chǎn)生熒光?？捎?1孔定量盤作為試驗的主容器，計數(shù)結果以MPN/100 mL表示。

3 銅綠假單胞菌的測定

銅綠假單胞菌原稱為綠膿桿菌，是一種革蘭氏陰性桿菌，是重要的水源和食源性致病菌。土壤、水、空氣、皮膚表面、呼吸道和腸道中都有該菌存在。它是一種條件致病菌，免疫力低下的老人和嬰幼兒易被感染，被燒傷燙傷的患者、有眼部疾病、血液病惡性腫瘤的患者，以及術后患者被感染后常使病情惡化，嚴重時可引起敗血癥。

銅綠假單胞菌的檢測方法是濾膜法。有多種培養(yǎng)基可作為選擇性培養(yǎng)基，其中最為常見的分離計數(shù)培養(yǎng)基為CN瓊脂培養(yǎng)基[12]。此法除了CN瓊脂培養(yǎng)基之外，還需要乙酰胺肉湯培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基、氧化酶試劑和鈉式試劑。將過濾后有菌的一面貼在CN瓊脂培養(yǎng)基上，于36±1℃條件下培養(yǎng)48 h，48 h后于波長360±20 nm處的紫外燈下觀察。藍/綠色、無熒光的菌落則直接判定為檢出；黃色有熒光的菌落做乙酰胺肉湯（產(chǎn)氨）試驗確認，加入鈉式試劑，若溶液顏色從黃色變?yōu)榇u紅色，則判定為陽性、檢出；紅褐色無熒光的菌落，先做產(chǎn)氨試驗，若結果為陽性則繼續(xù)進行氧化酶試驗。將新鮮的氧化酶滴于濾紙上，再將培養(yǎng)物涂布在上面，10 s內顯深藍紫色的為陽性；將氧化酶反應為陽性的培養(yǎng)物接于金氏B培養(yǎng)基上，于36±1℃條件下培養(yǎng)24 h以上，每天都取出在紫外燈下觀察，5 d內能產(chǎn)生熒光的菌落判斷為陽性。

鄧軍[13]在用上述方法檢測銅綠假單胞菌時還做了對照試驗，即將通過相同體積、相同水樣的濾膜貼在乙酰胺瓊脂培養(yǎng)基上，若出現(xiàn)扁平菌落且菌落周圍培養(yǎng)基變?yōu)樘壹t色則判定為檢出。CFC選擇性培養(yǎng)基也可作為分離計數(shù)的培養(yǎng)基，SN/T 2099—2008[14]中詳細介紹了配置方法，使用時應配合氧化酶、乙酰胺、葡萄糖酸鹽等使用，其中還需要革蘭氏染色。十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基也是銅綠假單胞菌選擇培養(yǎng)基中的一種。孟凡亞等人[15]比較了銅綠假單胞菌在十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基A和B上的菌落生長率。伊鋆等人[16]比較了上述幾種培養(yǎng)基的優(yōu)缺點，他們認為近些年發(fā)展起來的顯色培養(yǎng)基在各個方面均占優(yōu)勢，因此最適合定性、定量分離分析。

4 霉菌和酵母菌的測定

霉菌和酵母菌都屬于真菌，二者外觀的主要區(qū)別為霉菌有菌絲體，而酵母菌無菌絲體且大多為桿狀或圓形。它們繁殖能力強，若攝入過多會引起人體的菌群失衡，從而對人體造成危害。

梁美丹等人[17]比較了正置培養(yǎng)和倒置培養(yǎng)的檢出率，最終得出正置培養(yǎng)的檢出率高于倒置培養(yǎng)。試驗不但比較了2種培養(yǎng)方式，還采用了孟加拉紅和馬鈴薯-葡萄糖-瓊指2種不同的培養(yǎng)基。將水樣與培養(yǎng)基混勻后于28±1℃條件下培養(yǎng)5 d，在培養(yǎng)過程中應每天都進行觀察，防止霉菌過量生長而導致菌絲交錯影響觀察，必要時可以稀釋水樣或增加水樣的量，或用鏡檢法區(qū)分這2種菌。

張建明等人[18]認為用顯色紙片檢測霉菌和酵母菌具有比較好的效果，尤其是酵母菌。顯色紙片是再顯色培養(yǎng)基的基礎上，通過改進制造而成，操作簡單、方便攜帶，也不需要前期的準備工作，更兼有價格低廉、環(huán)保經(jīng)濟的特點。

5 病毒和原生動物的測定

病毒和微生物都是較為常見的病原微生物，其中，腸道病毒在自然水域中最為常見；腸炎病毒多見于被人畜糞便污染后的水源，對懷孕的婦女影響較大；輪狀病毒會使免疫力不高的嬰幼兒出現(xiàn)死亡的癥狀。常見的原生動物是賈第蟲和隱孢子蟲，前者會使人腹瀉，嚴重時可致人死亡；后者是其他致病微生物的中間宿主，它的蟲卵進入人體會帶來潛在威脅。

張敏等人[19]提到檢測病毒的方法比較多，但首先應用微孔過濾器對其進行收集，再開展洗脫、超濾、吸絮凝等過濾步驟。常規(guī)檢測方法為直接電鏡觀察，免疫技術是一種較為精準的方法，還可以運用分子生物學的方法，但運用這種方法時要將培養(yǎng)物反轉吸收起來，清除影響檢測結果的干擾物。馮萃敏等人[20]提到國外采用PCR技術來檢測水樣中的腸道病毒和甲肝病毒，其耗時與傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)相較縮短了50%。

檢測原生動物一般也用顯微鏡直接觀察，但容易漏檢，因此張敏等人[19]認為免疫熒光分子學檢測法也是認可度比較高的方法，劉志剛等人[21]研究建立了肝吸蟲蟲卵DNA的提取和PCR檢測方法，可快速檢測到蟲卵，具有特異性。

6 檢測細菌的新型方法及應用

ATP生物發(fā)光法[22]可以作為一種快速檢測飲用水樣中細菌總數(shù)的方法。這是一種以生物發(fā)光反應為基礎的快速檢測技術，它的優(yōu)點在于不需要培養(yǎng)過程，大大縮短了從取樣到檢出的時間。

環(huán)介導等溫擴增技術[23-24]是一種新型的恒溫核酸擴增技術，具有特異性強、靈敏度高、操作方便等特點，適用于大腸菌群和銅綠假單胞菌的檢測。

化學發(fā)光免疫分析技術[25]是一種利用抗原與抗體的特異性結合來選擇性識別和測定待測物的免疫分析方法，適用于對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細菌的檢測，一般分為競爭法和雙抗夾心法。

PCR技術是指在體外快速擴增基因和DNA序列的技術，可以快速準確地檢測大部分細菌，但其仍然存在一些不足之處，所以經(jīng)常與其他技術，如毛細管電泳技術協(xié)同使用[26]。而PCR技術也可以和核酸探針技術聯(lián)合使用[27]，以使其達到一個更高的精準程度。

7 殺滅微生物防治微生物感染的方法與注意事項

7.1 造成微生物超標的主要原因

水源受到污染[28]；生產(chǎn)車間設備條件差，沒有嚴格嚴肅的態(tài)度；滅菌操作人員不注意個人衛(wèi)生，攜帶微生物；回收的瓶、蓋消毒不徹底；運輸中因密封不嚴而導致空氣中微生物進入等。

7.2 解決方法

對水源進行徹底消毒；相關部門加大懲罰力度和執(zhí)行力，做好教育宣傳；相關操作人員應具備專業(yè)水平，企業(yè)應當提供讓他們不斷學習的機會；瓶、蓋徹底消毒，定期檢查機器；有些微生物生長和瓶子的材料有關，應避免使用微生物喜歡聚集生長的材料；紫外線對一般細菌殺滅效果較好，對霉菌卻無效，這時就可以采用液體超高溫瞬間滅菌技術殺滅霉菌。

7.3 其他注意事項

在檢驗微生物時，應當注意：①檢驗人員操作規(guī)范；②實驗室應當保持適宜的溫度和濕度，防止微生物生長過快或過慢；③保證實驗室的無菌機器沒有損壞，可存在無菌環(huán)境。

近年來，瓶裝水微生物指標不達標報道頻發(fā)，我國水質環(huán)境面臨著一個嚴峻的形勢，相關部門應當加強監(jiān)督管理、嚴格執(zhí)法；同時礦泉水企業(yè)也應當遵守相關規(guī)定，做良心商家；消費者更應該擦亮眼睛，謹慎購買，瓶裝水一旦開蓋，盡快飲用，切勿長時間存放，否則將有飲用含有超標微生物飲用水的危險。