桑葉中1-脫氧野尻霉素提取純化及檢測方法研究進(jìn)展

石萬銀，徐 劍，楊躍軍，劉源才，巫 岳，向詩銀，唐 萬

（勁牌生物醫(yī)藥有限公司，中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃石 435100）

桑葉為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥葉[1]，其化學(xué)成分含量豐富，主要含有黃酮、多糖、脂類、生物堿、揮發(fā)油、植物甾醇等成分[2]。現(xiàn)代研究表明，桑葉中生物堿類成分主要包括野尻霉素及其衍生物，如1-脫氧野尻霉素（DNJ）、N-甲基-1-脫氧野尻霉素、2-氧-α-D-半乳吡啶糖苷-1-脫氧野尻霉素、1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇、蕎麥堿、3-表蕎麥堿等[3]。其中，DNJ屬于強(qiáng)效α-葡萄糖苷酶抑制劑[4]，能降低二糖的消化和葡萄糖的吸收來降低餐后血糖。Yoskihuni Y[5]研究了大鼠服用DNJ后血糖的變化，結(jié)果表明，大鼠使用淀粉、蔗糖等碳水化合物時(shí)DNJ能抑制血糖上升，降低血糖峰值。施新琴等人[6]測定了7個(gè)家蠶品種或雜交組合、用5個(gè)桑品種和不同葉質(zhì)桑葉飼養(yǎng)5齡蠶制備的全蠶粉中1-DNJ含量，同時(shí)測定了由相應(yīng)的全蠶粉配制的蠶粉復(fù)合物對小鼠灌胃后1.5 h血糖值的影響。結(jié)果表明，不同家蠶品種、用不同桑品種和不同葉質(zhì)桑葉飼養(yǎng)家蠶制備的全蠶粉復(fù)合物的降血糖效果均存在顯著差異，凡是降血糖效果顯著的全蠶粉，1-DNJ含量都處于較高水平。胡竟一等人[7]研究了桑葉的α-葡萄糖苷酶抑制作用，結(jié)果表明，終質(zhì)量濃度25，50，100，200 mg生藥/mL的桑葉煎劑和桑葉生物堿均具有顯著的α-糖苷酶抑制作用，終質(zhì)量濃度100，200，400 mg生藥/mL的桑葉多糖抑制α-糖苷酶的作用不明顯，終質(zhì)量濃度50，100，200 mg生藥/mL的桑葉黃酮抑制α-糖苷酶的作用弱，說明桑葉生物堿是桑葉α-糖苷酶抑制作用的主要有效部位。

桑葉價(jià)廉易得，其DNJ降血糖活性好、安全性高，近年來DNJ逐漸被用于藥品和保健食品中，其分離純化和檢測、技術(shù)研究也逐漸深入，但存在DNJ在桑葉藥材中含量較低、分離純化工藝復(fù)雜，且DNJ本身無紫外吸收，常規(guī)檢測方法不適用等問題。通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，對DNJ分離純化技術(shù)和檢測方法研究進(jìn)行全面概述，以期為桑葉DNJ的分離純化及檢測提供參考。

1 DNJ的提取研究概況

1.1 水提取法

水作為DNJ提取最常用的溶劑，成本低、安全性高、方便易得，文獻(xiàn)報(bào)道中除用純水提取外常見的還有水中加入酸調(diào)節(jié)pH值、加入纖維素酶進(jìn)行DNJ提取。

1.1.1 水提取

胡瑞君等人[8]以無菌過濾水為溶劑，利用微波輔助提取技術(shù)，考查了微波功率、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)對桑葉DNJ得率的影響，確定了最佳提取條件為微波功率406 W，提取時(shí)間1.5 min，料液比 （藥材∶溶劑） 為1∶40（g∶mL），提取次數(shù)2次。劉樹興等人[9]以水為溶劑，通過單因素試驗(yàn)篩選對提取有顯著影響的因素，并通過正交試驗(yàn)確定1-脫氧野尻霉素（DNJ）和多糖提取最佳的方案，DNJ的最佳提取方案為料液比 1∶30，物料粒徑60目，提取溫度70℃，提取時(shí)間3 h。

1.1.2 酸水提取

魏曉蕊[10]比較了酸水和超聲波輔助提取對桑葉DNJ提取效果，其中酸水法提取條件為溶劑pH值2的水溶液，料液比25∶1，在70℃條件下提取2.5 h，DNJ提取率為0.166%，超聲波輔助提取條件為以水為溶劑，料液比1∶16，提取溫度75℃，微波功率350 W，提取時(shí)間 60 min（超聲 3 s，間隔 5 s），DNJ提取率為0.187%。

1.1.3 纖維素酶提取法

趙翔[11]通過對纖維素酶質(zhì)量濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行篩選，并采用響應(yīng)面法進(jìn)行酶法提取桑葉DNJ的工藝條件，確定桑葉DNJ的最佳提取條件為纖維素酶質(zhì)量濃度3.4 mg/mL，料液pH值3.8，料液質(zhì)量濃度0.017 0 g/mL，在60℃條件下提取1.0 h，桑葉DNJ的提取率為0.0950%。

1.2 乙醇提取法

乙醇作為常用的有機(jī)溶劑，安全性好且可以回收利用，常用作桑葉DNJ的提取。

1.2.1 乙醇提取

唐滿生等人[12]對桑皮的提取溫度、提取時(shí)間及乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行考查，確定桑皮中DNJ最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在60℃下提取2 h，得到提取物中DNJ的含量為3%左右。李宇亮等人[13]通過對桑葉提取方法考查，確定桑葉DNJ提取方法為以體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇為提取劑，按料液比1∶8超聲強(qiáng)化細(xì)胞破碎20 min（功率1 800 W）。

1.2.2 酸性乙醇提取

薛婷婷等人[14]采用乙醇從新鮮桑葉中提取DNJ，得到最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，pH值3.5，料液比1∶11，提取溫度55℃。馬靜[15]采用正交試驗(yàn)篩選出桑葉DNJ最佳提取條件為物料粒60目，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，pH值1，料液比1∶30，提取溫度55℃，DNJ得率為0.064%，含量為20.3%。關(guān)山[16]通過對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間進(jìn)行考查，確定桑葉DNJ最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比1∶8，回流提取1 h。

2 DNJ的分離純化研究概況

2.1 樹脂分離純化

羅蕾蕾等人[17]采用AB-8型大孔樹脂對桑葉提取液進(jìn)行除雜處理，然后將上樣液調(diào)節(jié)為pH值4后上732陽離子型樹脂，上樣速度為每小時(shí)1倍柱體積，用濃度為0.5 mol/L氨水進(jìn)行洗脫，收集pH值9～10的洗脫液濃縮干燥，得到桑葉提取物DNJ含量為16.7%。楊翠平[18]采用D72型陽離子交換樹脂、D296型陰離子交換樹脂和氧化鋁對桑葉DNJ進(jìn)行純化，其中D72型陽離子交換樹脂純化后，DNJ含量達(dá)到23.87%，是粗提液的15.12倍，樣品溶液利用D296型陰離子交換樹脂進(jìn)一步純化后，DNJ含量達(dá)到57.63%，比純化前提高了2.41倍，純化后的樣品經(jīng)過中性氧化鋁柱層析后，DNJ純度達(dá)到了63.92%，比純化前提高了1.12倍。孟夏[19]采用國產(chǎn)001*7型陽離子交換樹脂進(jìn)行桑葉DNJ純化，進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)、動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)，確定樹脂對DNJ飽和吸附量為13.8 mg/g，上柱流速為1.5 mL/min，洗脫液氨水濃度為0.5 mol/L，純化后得到DNJ含量為39.17%。

2.2 色譜柱分離純化

周惠燕等人[20]采用反向色譜柱進(jìn)行桑葉DNJ純化，桑葉加入酸水超聲提取、離心、濃縮干燥的固體加水溶解后過MCIgelCHP20P柱色譜，以不同濃度甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集含DNJ洗脫液濃縮，濃縮液過Sephadex LH-20型色譜柱，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗，收集洗脫液濃縮干燥，得到桑葉提取物DNJ含量為10.7%。

2.3 有機(jī)溶劑萃取

DNJ為極性化合物，有機(jī)溶劑萃取是采用相似相容的原理進(jìn)行，一般選擇極性較大的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。楊茹等人發(fā)明了一項(xiàng)從天然產(chǎn)物，包括桑葉、桑枝、桑白皮、桑椹、蠶沙，提取分離純度高于98%的DNJ的方法，樹脂純化后的濃縮液加入酸調(diào)節(jié)pH值6.5～7.5，以氯仿萃取，保留水相；水相以正丁醇萃取，保留正丁醇相，濃縮至小體積，收集析出的固相再加入無水乙醇重結(jié)晶；結(jié)晶后的產(chǎn)品溶于少量純水，通過凝膠柱層析，以標(biāo)準(zhǔn)品對照，收集薄層色譜Rf值和斑點(diǎn)顏色均一致部分，濃縮至干，得成品。其中，目標(biāo)產(chǎn)物1-脫氧野尻霉素含量不少于98%。李宇亮等人[13]將桑葉藥材用體積分?jǐn)?shù)65%乙醇超聲提取后過陽離子交換樹脂，氨水洗脫液濃縮后用正丁醇萃取，萃取液濃縮干燥后DNJ含量可達(dá)93.2%。

3 檢測方法研究概況

3.1 高效液相色譜法

DNJ通過高效液相色譜法進(jìn)行含量檢測時(shí)，一般先采用合適的衍生劑進(jìn)行衍生，生成具有紫外吸收的衍生絡(luò)合物后再進(jìn)行檢測，或者是采用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測。楊翠平等人[18]采用FOMC-Cl為衍生劑對DNJ進(jìn)行衍生，并在衍生后加入適量甘氨酸溶液以消除多余的衍生劑，采用inertsil HPLCNH2型色譜柱，以乙腈-水（75∶25）為流動(dòng)相，于波長256 nm處檢測DNJ，并進(jìn)行方法學(xué)考查。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定可靠，可用于檢測桑葉中DNJ含量。蔣磊等人以FOMC-Cl為衍生劑對DNJ進(jìn)行衍生，以乙腈-0.1%醋酸（55∶45）為流動(dòng)相，波長254 nm處檢測DNJ。結(jié)果表明，該操作方便、檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可以作為常用的DNJ檢測方法。梁建寧等人采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定桑白皮中1-脫氧野尻霉素的含量，色譜柱為Hypersil NH2柱，流動(dòng)相：乙腈-水（78∶22），蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度50℃，載氣流速2×105Pa。

3.2 高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法

戴開金等人采用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定桑葉中1-脫氧野尻霉，以乙腈-0.1%甲酸水溶液（12∶88，V/V）為流動(dòng)相，SHIMADZUHRCNH2型柱分離，采用大氣壓化學(xué)電離源（APCI），164.1/146.1，164.1/110.2兩對離子，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。結(jié)果表明，1-脫氧野尻霉素保留時(shí)間為2.87 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線在質(zhì)量濃度482～2 410 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 3），平均加樣回收率為95.8%，最低檢測限為53.6 μg/L。

3.3 氣相色譜法

李宏等人利用化學(xué)合成法將DNJ轉(zhuǎn)化成沸點(diǎn)較低的酯類物質(zhì)，建立了用氣相法快速檢測DNJ的新方法，檢測到桑葉中DNJ含量達(dá)到0.129 4%。汪孟夏等人采用毛細(xì)管柱氣相色譜法測定桑葉中DNJ含量，考查了不同溶劑和不同提取方式對桑葉中DNJ提取的影響，最終確定用吡啶作為提取試劑在超聲波條件下處理時(shí)間30 min為毛細(xì)管氣相色譜法測定DNJ的最佳提取條件。用醋酸苷作為乙?；噭}酸羥胺作為催化劑，在水浴90℃條件下乙?；?0min。通過方法學(xué)考查確定色譜條件為色譜柱OV-1701型，初溫285℃×5 min，以10℃/min上升至295℃，維持25 min，以20℃/min下降至285℃；汽化室溫度310℃，檢測口溫度310℃，氫氣流量47 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，火焰離子檢測器（FID），結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)語

（1） DNJ多采用水和乙醇進(jìn)行提取，常見的方法有微波提取法、超聲波輔助提取法和熱提取法，純水和乙醇只能將植物體內(nèi)游離的DNJ類成分提取出來，加酸后DNJ可與酸結(jié)合成鹽易于溶出，同時(shí)酸性條件可以使植物細(xì)胞壁發(fā)生軟化，有利于DNJ提??；纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，也是細(xì)胞內(nèi)活性成分溶出的屏障，用纖維素酶處理桑葉藥材，可以降解細(xì)胞壁中纖維素類成分，有利于細(xì)胞內(nèi)成分的溶出；適宜體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取還能避免一些水溶性雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖等）干擾。

（2） DNJ分離純化方法最常用的為樹脂分離純化，DNJ分子結(jié)構(gòu)中含有氨基，在溶液中帶正電荷，能與陽離子交換樹脂上的H+或Na+發(fā)生交換，然后再用帶正電荷的溶液（如氨水）將DNJ交換下來，操作方便，常用作大生產(chǎn)上DNJ的純化。有機(jī)溶劑萃取也能提高桑葉DNJ含量，但毒性大、成本高，桑葉DNJ多作為保健食品原料，有機(jī)溶劑萃取存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，色譜柱分離純化可得到純度較高的化合物，但批量小，這2種方法在生產(chǎn)上應(yīng)用較少。

（3） DNJ分子結(jié)構(gòu)與糖類似，分子中無共軛基團(tuán)，也無紫外吸收，且水溶性好、極性大，用紫外檢測器、C18反向色譜柱檢測困難，質(zhì)譜法與氣相色譜法檢測方法復(fù)雜且儀器成本高，故目前多用氨基柱，柱前衍生法-高效液相色譜法或者蒸發(fā)光散射檢測器-高效液相色譜法進(jìn)行DNJ含量檢測。