急性肝胰腺壞死病試驗方法的研究進展

彭張明，蒲桂川

（海南海壹水產(chǎn)種苗有限公司，海南 海口 571126）

對蝦的急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）是近年來出現(xiàn)的一種新型致命性、細菌性疾病，該病最初被稱為早期病死綜合征（EMS）和急性肝胰腺壞死綜合征（AHPND）[1]。國內(nèi)外對該疾病的發(fā)生、流行病學(xué)、病原學(xué)、耐藥性、易感物種、臨床體征、組織病理學(xué)、預(yù)防、治療和診斷等重要信息做了大量研究，使人們更進一步認識了該疾病。該文主要從目前已開展的AHPND病原研究、AHPND試驗處理及AHPND致病性生物測定3個方面內(nèi)容出發(fā)，進行AHPND有關(guān)試驗方法的綜述，以期為進一步研究AHPND和其他蝦類疾病提供潛在的指導(dǎo)方向。

1 急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）病原研究

1.1 AHPND發(fā)生與流行

AHPND的暴發(fā)通常在放苗或室外標(biāo)粗約35 d左右，嚴重時10 d左右便會發(fā)生，病死率達到40%～100%[2-3]，該疾病最先導(dǎo)致了2009年中國[4]、2011年越南和馬來西亞、2012年泰國[1]、2013年墨西哥[5]、2015年菲律賓[6]和2016年南美洲[7]等養(yǎng)殖區(qū)域的對蝦大量病死，亞洲對蝦養(yǎng)殖每年因AHPND造成的生產(chǎn)損失估計高達10億美元[1]。2011年上半年造成我國海南、廣東、福建和廣西80%對蝦養(yǎng)殖場發(fā)病[8]，中國的對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模大，養(yǎng)殖環(huán)境更是復(fù)雜多樣化，AHPND的爆發(fā)范圍也極其廣泛，未來該疾病仍會長期影響中國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。此外，該病通常在高溫干旱季節(jié)的高鹽、高堿養(yǎng)殖池中具有較高的發(fā)病幾率[9]，據(jù)報道斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）和中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）都是AHPND的易感種群[1-2，10]。

1.2AHPND致病原

Tran等[11]成功確定了滿足柯赫假設(shè)的AHPND致病原（VpAHPND），一株革蘭氏陰性桿狀毒株，嗜鹽海洋性副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus），但與已知的副溶血性弧菌分離株的基因不同[12]，這種新菌株攜帶一個或多個染色體外的70 kbp左右質(zhì)粒（pVA1），該質(zhì)粒可編碼與光桿菌同源的昆蟲相關(guān)致命二元毒素（pirAvp和pirBvp），從而表現(xiàn)出高致病性[13]，因此不是所有副溶血弧菌都表現(xiàn)出AHPND致病性。然而，通過基因組測序發(fā)現(xiàn)，一些非副溶血性弧菌屬的AHPND致病原也被確定攜帶pVA1-like質(zhì)粒，如哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、歐文斯氏弧菌（Vibrio owensii）和坎貝氏弧菌（Vibrio campbellii），因此，在某些情況下，AHPND可能不單是由副溶血弧菌引起，甚至其他弧菌屬也能引起[4，14-16]。

1.3AHPND診斷方法

1.3.1 AHPND臨床體征 對蝦早期感染AHPND的一系列體征包括：嗜睡，厭食，生長緩慢，肝胰腺發(fā)白、明顯的萎縮（50%或50%以上），甲殼變軟、易被剝離，空腸空胃，用拇指和食指不能輕易碾碎肝胰腺，垂死的蝦沉底等，這些臨床體征和死蝦可以最早在放苗10 d內(nèi)觀察到，在疾病的末期，肝胰腺會出現(xiàn)黑色條紋或斑點[4，17-18]。

1.3.2 AHPND組織病理觀察 AHPND組織病理觀察僅限于對蝦消化系統(tǒng)的肝胰腺，通過觀察可發(fā)現(xiàn)患病對蝦肝胰腺出現(xiàn)大面積壞死，肝胰腺盲管從中段到末端發(fā)生變性，盲管上皮細胞壞死、脫落，細胞核腫大，分泌細胞（B cells）、高嗜堿性細胞（F cells）和脂肪儲存細胞（R cells）的細胞數(shù)量減少、退化及功能紊亂，胚細胞（E cells）有絲分裂能力顯著降低，在后期肝胰腺盲管間或盲管內(nèi)發(fā)生血細胞浸潤，進而肝胰腺出現(xiàn)繼發(fā)性細菌感染，最終疾病末期完全被破壞[11，19]。

1.3.3 AHPND的PCR診斷 亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)絡(luò)（NACA）最早公布的AHPND一種PCR診斷方法是質(zhì)粒（pVA1）序列為靶點的兩條引物[20]，Tinwongger等[21]向外界公布了第一種以100%準(zhǔn)確率靶向AHPND毒素pirAvp基因的一步式PCR方法，Dangtip等[22]引入了同時擴增pirAvp和pirBvp基因的增強型嵌套兩步PCR方法，Han等[23-24]先后引入了擴增pirAvp和pirBvp基因的雙重PCR方法以及可檢測和定量AHPND致病菌株編碼pirAvp毒素pirAvp基因的TaqMan定量PCR（qPCR）方法。此外還出現(xiàn)了用于AHPND致病菌株的現(xiàn)場檢測的三環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）方法，以及多種病原檢測的多重PCR方法[25-26]。

2 急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）試驗處理方法

2.1 AHPND樣品處理

AHPND是一種細菌性疾病，根據(jù)目前PCR檢測方法的有效性，該致病菌株可以確定普遍存在蝦、池塘水、沉積物、飼料、藻類、糞便、蝦苗及親蝦促熟時飼喂的活餌中，因此以上樣品都是適宜于AHPND檢測[27]。AHPND致病菌株經(jīng)口轉(zhuǎn)移并定植蝦的消化系統(tǒng)中，釋放毒素，隨后損害消化腺或肝胰腺，因此，與蝦消化系統(tǒng)相關(guān)的組織和器官，如肝胰腺、胃、中腸和后腸，是最適合診斷AHPND的樣品，其他組織和器官也可以根據(jù)特定研究的目的進行特定的試驗[10]，此外檢測樣品最好是現(xiàn)取、活的，若是用于分子試驗，樣品可以固定在100%乙醇中[28]。

2.2 AHPND樣品菌株分離與保存

進行樣品菌株分離時，要對樣品表面無菌處理、粉碎并單獨接種到用于分離副溶血性弧菌的肉湯或其他培養(yǎng)基中，例如堿性蛋白胨培養(yǎng)基（APW）、1.5%～2.5%氯化鈉胰蛋白酶大豆肉湯（TSB+）或胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA+）、TCBS瓊脂及科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基等[3]。AHPND致病菌株在TCBS和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上分別表現(xiàn)為綠色和淡紫色菌落，接種的培養(yǎng)液和瓊脂平板可在室溫或28～35℃（最好與養(yǎng)殖和取樣蝦的水溫相同）培養(yǎng)18～24 h[3,5]。分離純化后的菌種必須種到含有TSB+的試管中（1%～2%氯化鈉），加入10%～50%的甘油，并保存在-80℃超低的冰箱中，若要使用可將菌種部分解凍，再接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，或在適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基上劃線，以確定其純度[3,22]。

2.3AHPND細菌富集與DNA提取

將肝胰腺、胃、糞便、蝦苗和環(huán)境物質(zhì)等樣品進行初步細菌富集，可以在TSB+中接種，然后在30℃左右連續(xù)搖動培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)后的樣品放置一段時間，讓所有碎片沉淀下來，通過離心分離去除混濁上清液，以獲得用于DNA提取和PCR檢測的細菌顆粒，從而得到更強的PCR譜帶[29-30]。DNA的提取可使用常用DNA提取方法或商用DNA提取試劑盒，例如利用沸騰法粗提取細菌基因組DNA，是在含有3%氯化鈉的心浸液（HI）瓊脂平板上在30℃下培養(yǎng)細菌過夜，然后將一個菌落接種到50 uL無菌蒸餾水中，在95℃下加熱2 min，然后離心1 min，然后收集上清液進行PCR反應(yīng)[21]。

2.4 AHPND菌株鑒定與基因組測序

通過鳥槍測序法對從感染AHPND的蝦身上擴增出的細菌小亞基核糖體DNA基因（ssrDNA）片段進行測序，結(jié)果表明，AHPND致病菌株的序列與感染其他弧菌的患病蝦身上常見的序列不相關(guān)[31]。隨著全世界范圍內(nèi)對AHPND研究的不斷深入，不同區(qū)域、不同類型的AHPND致病菌株信息被上傳到DDBJ/GenBank/PubMLST數(shù)據(jù)庫中。從越南、泰國、墨西哥和拉丁美洲等地受AHPND感染的養(yǎng)殖場得到并確定，在一些副溶血性弧菌菌株中，存在兩大類pirAvp和pirBvp基因缺失和突變的類型，I型突變體是pirAvp和pirBvp基因全部缺失，標(biāo)記為pirABvp(－)，Ⅱ型突變體是小部分缺失，即包含pirAvp基因以及部分pirBvp基因，標(biāo)記為pirAvp(－)。實驗室通過對AHPND突變菌株致病性的生物測定試驗，結(jié)果顯示該菌株對蝦沒有致病性，因此證實了AHPND致病性菌株需要pirAvp和pirBvp基因[32]。

3 急性肝胰腺壞死病（AHPND）致病性生物測定

3.1 AHPND致病菌株與試驗動物準(zhǔn)備

將AHPND致病菌株接種到合適的肉湯培養(yǎng)基（如TSB+和APW）中，以進行AHPND致病性生物測定，試驗的菌群密度必須要達到約2×108CFU/mL，是已經(jīng)被證明可導(dǎo)致高病死率和明顯AHPND病理特征的密度[3]。在試驗處理前，試驗蝦須在相同的實驗池中一直在良好的條件和適當(dāng)?shù)拿芏认埋Z養(yǎng)，蝦必須以大約12 h的間隔以10%的生物量的水平喂食（Nunan等），每次進食2 h后，必須將未食用的飼料全部從水中撈出[11,27]。

3.2 AHPND浸泡試驗

浸泡是檢測細菌毒性最適合的方法之一，NACA也建議用這種方法來進行AHPND生物測定試驗，它已經(jīng)揭示了AHPND可通過浸泡進行感染，可導(dǎo)致100%的病死率，并伴有典型的AHPND病理特征[3]，賈丹等通過患病中國明對蝦體內(nèi)分離出一株副溶血弧菌，經(jīng)過急性浸泡感染試驗，18 h病死率高達到100%[33]。

3.3 AHPND反飼試驗

反飼，也被稱為改良灌胃或強制喂食，是通過將含有傳染性物質(zhì)的懸浮液通過蝦的肛門進入前中腸區(qū)域以及其與肝胰腺的連接處，用極少量的細菌引起感染，故不太可能對蝦造成創(chuàng)傷。將30 mL的含AHPND致病菌株（約2×109CFU/mL）的TSB+肉湯培養(yǎng)液，在28℃下培養(yǎng)18 h后，再以6 000轉(zhuǎn)/min的速度持續(xù)離心5 min，得到的上清液通過0.2 μm的過濾器過濾后進行反飼實驗，試驗蝦與浸泡實驗的蝦都出現(xiàn)了相似的AHPND組織病理損傷，這些結(jié)果表明，無細菌的上清液能夠通過反飼處理后誘導(dǎo)試驗蝦的AHPND病理，反過來可以為推論AHPND病變是由細菌毒素引起提供初步證據(jù)[3]。需要注意的是，接受反飼處理的蝦在傳染性物質(zhì)給藥前至少6 h內(nèi)不得進食，以確保其中腸是空的[27]。

3.4 AHPND口服試驗

在養(yǎng)殖過程中有害病原主要是通過對蝦的攝食進入體內(nèi)，經(jīng)過消化系統(tǒng)后在肝胰腺及腸道內(nèi)進行大量繁殖，這是養(yǎng)殖過程中引起對蝦感染疾病的主要途徑之一。通過口服方式進行AHPND致病性試驗可以最大程度的還原及模擬對蝦獲取致病原的過程，能夠最有效體現(xiàn)導(dǎo)致感染的自然途徑[34,13]。在越南投喂冷凍的AHPND感染蝦體作為致病原，結(jié)果是實驗蝦未能產(chǎn)生與AHPND一致的肝胰腺病理體征，可能是由于經(jīng)冷凍處理后的感染蝦體，其致病菌的含量驟降、失活以至不能被檢測到[3]。但是在墨西哥將顆粒蝦飼料與在TSB+中的致病菌（約2×108CFU/mL）混合 10 min 后，進行過夜培養(yǎng)，將處理過的顆粒給蝦攝食，誘導(dǎo)了試驗蝦體內(nèi)出現(xiàn)AHPND病理體征[5]。同樣要注意的是，蝦在試驗之前，至少6 h內(nèi)不得攝入任何食物[27]。

3.5 AHPND肌肉注射試驗

對蝦腹部肌肉注射進行毒力研究早已大量運用，由于這種方法能誘導(dǎo)發(fā)生自然細菌性疾病，例如蝦的表皮損傷、蛻皮或自然菌群失調(diào)，因此肌肉注射不推薦作為確定AHPND致病性的方法。黃志堅等[35]通過向?qū)ξr腹部肌肉注射副溶血弧菌引起健康對蝦得到AHPND的典型癥狀，另外一個研究是，在試驗蝦的第三腹節(jié)進行肌肉注射50 μL從感染AHPND蝦分離的弧菌菌液（103CFU/蝦），在注射后6 h內(nèi)確實造成高病死率，通過肝胰腺組織病理分析發(fā)現(xiàn)，肝胰腺小管上皮細胞部分塌陷成未分化的細胞，卻沒有細胞大量脫落的特征，因此，雖然該菌株對蝦具有高致病性，但通過肌肉注射不會引起AHPND 病理[36]。

4 總結(jié)與展望

AHPND是一種全球性、全世界范圍內(nèi)的對蝦傳染性疾病，造成了對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)巨大損失，對整個產(chǎn)業(yè)都構(gòu)成了大的威脅，這一事實也使得對該疾病的生物監(jiān)測、診斷和管理必將成為一個更大的挑戰(zhàn)。據(jù)報道這種疾病是通過從AHPND池塘的共生或水誘導(dǎo)健康蝦發(fā)生，然而，迄今為止還沒有詳細、合適的感染途徑開展共生傳播試驗的模型[1，36]，今后可能還要根據(jù)其他蝦類疾病的共生傳播模型開展設(shè)計及修改。此外，包括AHPND致病菌株的耐藥性及食品安全問題，研究AHPND病原實驗室的生物安全和生物安保原則，AHPND疫病防控的生物安保理念推廣[37]等方面都要大力推進，以降低病原對水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的傳入、定植和擴散的風(fēng)險，形成水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖管理、技術(shù)和設(shè)施上執(zhí)行的一整套措施，保障水產(chǎn)健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。