細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白(CDCAs)與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的生物信息學(xué)分析*

劉婧婷， 隆建萍， 金鳳玲， 林碧玉， 王文第， 裴建贏， 王晶晶

蘭州大學(xué)1 第一臨床學(xué)院 3第一醫(yī)院感染管理科，蘭州 730000 甘肅省婦幼保健院2 乳腺一科 4婦幼保健科研中心，蘭州 730050

乳腺癌(breast cancer，BC)是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2018年新診斷的乳腺癌約210萬(wàn)例，全球死亡人數(shù)626679人[1]。雖然對(duì)乳腺癌發(fā)生的潛在機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，但乳腺癌患者，尤其是女性患者的生存率仍然較低。因此，創(chuàng)新有效的治療方法和新藥的研發(fā)是非常重要的。細(xì)胞分裂是生命的關(guān)鍵過(guò)程。許多研究已經(jīng)證明，細(xì)胞分裂過(guò)程中的功能障礙會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[2-6]。細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白(cell division cycle-associated protein，CDCAs)家族由8個(gè)成員組成(CDCA1～8)。CDCA1對(duì)核分裂和微管的穩(wěn)定性至關(guān)重要[7]。CDCA2編碼細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的靶向亞基——蛋白磷酸酶1γ(protein phosphatase 1γ，PP1γ)，在細(xì)胞周期中參與核膜的重組并調(diào)控DNA損傷[8]。CDCA3的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，在細(xì)胞周期的G1期通過(guò)蛋白降解和轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)水平[9]。CDCA4是細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子，其編碼的蛋白屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族，主要分布在核有絲分裂器上，與G1/S期的轉(zhuǎn)變有關(guān)[10]。CDCA5是細(xì)胞分裂過(guò)程中姐妹染色單體內(nèi)聚合和分離的重要調(diào)控因子，在DNA修復(fù)中起著重要的作用[11]。CDCA7是c-Myc的直接靶基因，該基因的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[12]。CDCA8是有絲分裂的重要調(diào)控因子，其編碼的復(fù)合物可調(diào)控染色質(zhì)誘導(dǎo)的微管穩(wěn)定和紡錘體形成[13]。然而，CDCAs的差異表達(dá)及其在乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值仍有待闡明。因此，本研究利用大樣本、高通量多數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌中CDCAs的表達(dá)情況及臨床意義，以期為探索乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后判斷等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)

基因表達(dá)數(shù)據(jù)取自公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus， GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。檢索詞為“breast cancer”和“Homo sapiens[porgn：__txid9606]”，總共檢索到81400個(gè)關(guān)于人乳腺癌數(shù)據(jù)集。納入研究的數(shù)據(jù)需同時(shí)包括乳腺癌組織樣本和正常乳腺組織樣本，且每組樣本在10個(gè)以上。篩選后選擇3個(gè)基因表達(dá)譜(GSE45827、GSE65194、GSE61304)，這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)基于平臺(tái)GPL570([HG -U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。從TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)下載原始數(shù)據(jù)，通過(guò)RSEM標(biāo)準(zhǔn)化。納入的數(shù)據(jù)基本信息見(jiàn)表1。

表1 本文納入的乳腺癌基因芯片基本信息Table 1 Basic information of four GEO datasets of breast cancer

1.2 差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)的篩選

從GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載的乳腺癌相關(guān)微陣列數(shù)據(jù)使用R軟件處理(版本3.6.1，https：//cran.r-project.org/)。使用limma包在R軟件中分析乳腺癌組織與正常乳腺組織之間的DEGs，計(jì)算FC(fold-change)值，并根據(jù)P<0.01和|log FC|≥2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步選擇。在GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//gepia.cancer-pku.cn/)驗(yàn)證所選取的DEGs在不同腫瘤中的表達(dá)情況[14]，在“Single Gene Analysis”模塊輸入所選取的DEGs，設(shè)置“P<0.05、|log FC|≥1”作為篩選條件，Jitter Size設(shè)置為0.4，對(duì)照樣本選擇“Match TCGA normal and GTEx data”。

1.3 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析

Oncomine(https：//www.Oncomine.org)是一個(gè)用于全基因組表達(dá)分析公開(kāi)的癌癥基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)[15]。該數(shù)據(jù)庫(kù)包含715個(gè)數(shù)據(jù)集，86733例正常組織和腫瘤樣本。本文利用Oncomine分析了乳腺癌及相應(yīng)正常組織中CDCAs的轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)挖掘和處理分析

Kaplan-Meier Plotter(www.kmplot.com)是一個(gè)在線工具，能夠評(píng)估21種癌癥類型中54000多個(gè)基因?qū)ι媛实挠绊?，?shù)據(jù)集包括乳腺癌(6234例)、卵巢癌(2190例)、肺癌(3452例)和胃癌(1440例)[16]，該數(shù)據(jù)庫(kù)納入了GEO、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中基因表達(dá)信息及臨床生存信息。本文使用Kaplan-Meier Plotter評(píng)價(jià)CDCAs表達(dá)水平的預(yù)后價(jià)值，采用Kaplan-Meier繪圖儀計(jì)算CDCAs表達(dá)中位數(shù)，將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用log-rank檢驗(yàn)分析Kaplan-Meier生存曲線，計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度(hazard ratio，HR)、95%可信區(qū)間和P值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要評(píng)估乳腺癌患者的整體生存率(overall survival，OS)、無(wú)復(fù)發(fā)生存率(recurrent-free survival，RFS)和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率(distant metastasis-free survival，DMFS)這3個(gè)指標(biāo)。

1.5 DEGs的功能富集分析

使用基因本體(Gene Ontology，GO)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分析3個(gè)獨(dú)立類別的豐富基因功能：生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞成分(cellular component，CC)[17]。使用基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG)來(lái)分析基因的相關(guān)通路[18]。使用DAVID(Database for Annotation Visualization and Integrated discovery)在線工具(https：//david-d.ncifcrf.gov/)進(jìn)行DEGs的GO和KEGG信號(hào)通路分析[19]，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

STRING(The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，https：//string-db.org/)在線工具用于檢測(cè)DEGs之間的蛋白質(zhì)相互作用，用組合得分>0.9提取PPI，通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行可視化PPI網(wǎng)絡(luò)[20]。利用Cytoscape軟件中的MCODE(Molecular Complex Detection Technology)插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)中的功能模塊，CytoHubba插件用于計(jì)算每個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的MCC(maximal clique centrality)，前30個(gè)基因被確定為關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者中的DEGs

根據(jù)P<0.01和|logFC|≥2的標(biāo)準(zhǔn)，在數(shù)據(jù)集GSE45827、GSE65194、GSE61304中，共有2879個(gè)DEGs，其中顯著上調(diào)的有2015個(gè)，包括細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白家族成員CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA5、CDCA7、CDCA8，顯著下調(diào)的有864個(gè)。隨后進(jìn)行維恩分析以得到DEGs維恩圖，見(jiàn)圖1。

圖1 乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)集中DEGs分析Fig.1 Identification of DEGs in breast cancer microarray datasets

2.2 CDCAs在乳腺癌組織和正常組織之間的表達(dá)差異

首先，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析了不同癌癥類型和相應(yīng)正常組織中CDCAs的轉(zhuǎn)錄水平，見(jiàn)圖2。與正常組織相比，CDCA1/2/3/5/7/8在腫瘤組織中mRNA水平升高，特別是在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中。在腫瘤組織中，CDCA3在48個(gè)數(shù)據(jù)集中顯著升高，4個(gè)數(shù)據(jù)集中下降；CDCA5在52個(gè)數(shù)據(jù)集中表達(dá)升高，4個(gè)數(shù)據(jù)集中表達(dá)降低；CDCA8在41個(gè)數(shù)據(jù)集中高表達(dá)，在3個(gè)數(shù)據(jù)集中低表達(dá)。

數(shù)據(jù)類型為mRNA；P值≤0.05；|logFc|≥2；基因排名≤10%；基因表達(dá)水平由格子內(nèi)顏色的深度來(lái)表示；與正常組織相比，紅色代表腫瘤組織中靶基因的過(guò)表達(dá)，而藍(lán)色則代表基因表達(dá)下調(diào)圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中不同腫瘤CDCAs mRNA表達(dá)水平的差異Fig.2 Difference in mRNA expression levels of CDCAs in various cancers based on Oncomine analysis

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CDCAs在不同腫瘤組織的表達(dá)有差異，見(jiàn)圖3。在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌癌組織中，CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA5、CDCA8表達(dá)量明顯高于正常組織(均P<0.05；其中，乳腺癌樣本n=1085與正常樣本n=291)。為了進(jìn)一步分析CDCAs表達(dá)水平與乳腺癌分期的關(guān)系，在“Single Gene Analysis”模塊中的“Stage Plot”頁(yè)面進(jìn)行分析，輸入所選取的CDCAs，CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA5、CDCA8表達(dá)水平在乳腺癌不同分期均有顯著差異(均P<0.01)，F(xiàn)值和P值見(jiàn)圖4中右上角標(biāo)注信息。

*P≤0.05圖3 CDCA基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)各種癌組織和正常組織中的表達(dá)差異Fig.3 Differential expression data for CDCA genes in a variety of normal and cancerous human tissues in TCGA database

2.3 CDCAs對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響

使用Kaplan-Meier Plotter在線分析工具評(píng)估CDCAs的表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示：CDCAs的表達(dá)水平與乳腺癌患者的總生存時(shí)間之間存在關(guān)聯(lián)，總體來(lái)說(shuō)，CDCAs的表達(dá)水平增高提示患者預(yù)后不良。與CDCA2/3/5/8高表達(dá)組相比，CDCA2/3/5/8低表達(dá)組乳腺癌患者的OS更長(zhǎng)，預(yù)后更佳(均P<0.05)，相對(duì)危險(xiǎn)度(HR)及其95%可信區(qū)間及P值分別在圖中右上角標(biāo)注，見(jiàn)圖5A。乳腺癌患者RFS與CDCA1/2/3/5/7/8高度相關(guān)，CDCA1/2/3/5/7/8表達(dá)較高者，RFS較短(均P<0.05)，見(jiàn)圖5B。CDCA2/5/7/8表達(dá)較低的乳腺癌患者DMFS更長(zhǎng)(均P<0.05)，見(jiàn)圖5C。

圖4 CDCA基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌組織不同分期的表達(dá)差異Fig.4 Differential expression of CDCA genes in breast cancer tissues of all stages in TCGA database

A：CDCAs在乳腺癌患者中的預(yù)后價(jià)值-整體生存率；B：CDCAs在乳腺癌患者中的預(yù)后價(jià)值-無(wú)復(fù)發(fā)生存率；C：CDCAs在乳腺癌患者中的預(yù)后價(jià)值-無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率圖5 CDCA1/2/3/5/7/8在乳腺癌患者中的預(yù)后價(jià)值Fig.5 Prognostic value of CDCA1/2/3/5/7/8 in breast cancer patients

2.4 DEGs的GO、KEGG富集分析和通路分析

使用DAVID在線網(wǎng)站進(jìn)行DEGs的GO富集分析，共有2630個(gè)基因的探針號(hào)能夠被識(shí)別。篩選條件設(shè)為P≤0.01，篩選CDCA相關(guān)的DEGs得到：

①生物過(guò)程(BP)中主要作用于細(xì)胞周期、有絲分裂細(xì)胞周期、細(xì)胞有絲分裂M期、細(xì)胞分裂、細(xì)胞器分裂、核分裂、染色姐妹單體分離等，詳見(jiàn)圖6A；②細(xì)胞成分(CC)作用點(diǎn)主要作用于染色體、著絲粒、紡錘體、核仁、微管細(xì)胞骨架、非膜結(jié)合的細(xì)胞器，詳見(jiàn)圖6B；③分子功能(MF)主要作用于染色質(zhì)結(jié)合和蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性，詳見(jiàn)圖6C。使用DAVID在線網(wǎng)站進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，篩選條件設(shè)為P≤0.01，得到27條信號(hào)傳導(dǎo)通路，詳見(jiàn)圖6D。

A：生物過(guò)程；B：細(xì)胞成分；C：分子功能；D：KEGG信號(hào)通路富集分析圖6 乳腺癌中DEGs的GO、KEGG功能分析Fig.6 GO and KEGG functional analysis of DEGs in breast cancer

2.5 CDCAs蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)及功能分析

PPI網(wǎng)絡(luò)共涉及1278個(gè)節(jié)點(diǎn)和6040個(gè)邊緣，見(jiàn)圖7A。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)中的連通度評(píng)估了MCC前30個(gè)基因，見(jiàn)圖7B。

A：蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的可視化；B：PPI網(wǎng)絡(luò)MCC排名前30的基因圖7 乳腺癌DEGs蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的可視化Fig.7 Visualization of the PPI network of DEGs in breast cancer

結(jié)果顯示KIF2C是最突出的基因(Rank=1)，其次是CDC20、CCNB1、CDK1、NDC80、CDCA8、BUB1、CCNB2、BUB1B、CENPF、BIRC5(Rank=2)；AURKB(Rank=13)、PLK1(Rank=14)、MAD2L1(Rank=15)；CENPE、SMC3、WAPAL、ZWINT、SMC1A、RAD21、CKAP5、RANGAP1、NUF2、ESPL1、PPP2R5C、PPP2R1B、KNTC1、ZWILCH、CDCA5(Rank=16)。

3 討論

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，以其較高的病死率嚴(yán)重威脅著女性的健康。為了預(yù)防乳腺癌的發(fā)生，盡可能做到“早診斷、早治療”，尋找針對(duì)乳腺癌早期分子標(biāo)志物的藥物靶點(diǎn)，對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后極為重要。CDCAs是細(xì)胞增殖過(guò)程中的調(diào)控因子，在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織和正常乳腺組織中，CDCA基因家族有不同的mRNA表達(dá)水平，CDCA2、CDCA3、CDCA5和CDCA8的過(guò)度表達(dá)與乳腺癌患者整體生存期相關(guān)。許多研究表明，細(xì)胞分裂過(guò)程中的失調(diào)都可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，有絲分裂主要涉及染色體事件(如：染色體濃縮、姐妹染色單體分離)和細(xì)胞骨架事件(如：核被膜破裂、染色體運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分裂等)，這些過(guò)程是由蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶的競(jìng)爭(zhēng)作用調(diào)控的，如發(fā)生異常則會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[21-23]。目前，以CDCA基因家族作為預(yù)后因子的研究引起了人們的關(guān)注[24-26]。然而，關(guān)于CDCA基因家族在乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中的作用機(jī)制還缺乏系統(tǒng)的分析。

本研究基于生物信息學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中CDCA1/2/3/5/7/8的表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明CDCAs可能在乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用。CDCA2的功能是結(jié)合蛋白磷酸酶1γ(PP1γ)和細(xì)胞周期控制DNA損傷反應(yīng)[27]。Shi等[28]的研究表明，CDCA2可下調(diào)Cyclin E1(CCNE1)表達(dá)，進(jìn)而使得肺腺癌細(xì)胞G1期延長(zhǎng)，而CDCA2的過(guò)表達(dá)則可上調(diào)CCNE1，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖分化。本研究中，通過(guò)GO富集分析結(jié)果顯示，CDCAs可介導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂過(guò)程，與Shi等的研究結(jié)果部分一致。CDCA3可觸發(fā)有絲分裂并控制細(xì)胞周期過(guò)程，研究表明，CDCA3的表達(dá)異常與肝癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等的發(fā)生有關(guān)[29-30]。Adams等[31]的研究證實(shí)，CDCA3在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，高水平的CDCA3與患者預(yù)后不良相關(guān)。同樣，在本文的研究中，CDCA3在乳腺癌組織中表達(dá)水平高于正常乳腺組織，且與較短的OS、較差的預(yù)后高度相關(guān)。CDCA5也被認(rèn)為是癌基因，有文獻(xiàn)報(bào)道在多種類型的癌癥中存在表達(dá)水平異常[32]。CDCA5在DNA修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，并參與姐妹染色單體的聚合和分離過(guò)程[33]。Nguyen等[34]的研究表明，CDCA5過(guò)表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良有關(guān)，同樣本文的研究也證實(shí)CDCA5的表達(dá)與乳腺癌患者的整體生存率、無(wú)復(fù)發(fā)生存率和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率存在明顯的相關(guān)性。CDCA8被認(rèn)為是一種潛在的癌基因，研究表明，其在肺癌、胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，但在正常組織中表達(dá)非常低或缺失[35-36]。Yu等[37]的研究表明，CDCA8在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞系(MCF7/ TamR和T47D/TamR)中顯著升高，CDCA8表達(dá)的下調(diào)顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖和他莫昔芬耐藥。相反，CDCA8過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了他莫昔芬敏感的乳腺癌細(xì)胞系(MCF7和T47D)的增殖并誘導(dǎo)其對(duì)他莫昔芬的耐藥性。CDCA8是乳腺癌中三苯氧胺耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子，提示CDCA8可能是乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究中，CDCA1/2/3/5/7/8在乳腺癌中表達(dá)顯著升高，提示可能與乳腺癌的發(fā)展和進(jìn)展存在相關(guān)性。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，CDCAs可能參與介導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂、染色姐妹單體分離等過(guò)程，同時(shí)還可能參與調(diào)節(jié)染色體、著絲粒、紡錘體、核仁等細(xì)胞成分的合成。此外，生存分析結(jié)果顯示，CDCA2/3/5/8低表達(dá)組的乳腺癌患者其總體生存期更長(zhǎng)，預(yù)后更佳；而CDCA1/2/3/5/7/8表達(dá)水平增高時(shí)，患者復(fù)發(fā)率也會(huì)有一定程度的增加。因此，這些CDCAs有望成為乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。本研究系統(tǒng)分析了乳腺癌中CDCAs的表達(dá)水平和預(yù)后價(jià)值，認(rèn)為CDCA2/3/5/8可能是治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)，為深入了解乳腺癌分子生物學(xué)的復(fù)雜機(jī)制提供了依據(jù)。然而，本文的研究數(shù)據(jù)僅來(lái)源于GEO、TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)，雖然多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)間的研究結(jié)果可以相互印證，但未通過(guò)臨床標(biāo)本及分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并且關(guān)于CDCAs調(diào)控miRNAs及其參與機(jī)制仍不清楚，因此，仍需要進(jìn)行大量的研究來(lái)發(fā)現(xiàn)這些機(jī)制，從而找到合適的癌癥臨床治療方法。