家蠶抗BmNPV品種選育研究進展

何艷茹 夏冬梅 袁桂陽 曹寧寧 肖 慧 陳永波

(四川省南充蠶種場，四川南充 637000)

家蠶(BombyxmoriL)起源于中國，由棲息于桑樹的原始野蠶馴化而來，已有五千多年的歷史，是迄今為止唯一被人類完全馴化的經(jīng)濟昆蟲。家蠶以桑葉為食，其繭可繅絲，蛹可食用，具有重要的經(jīng)濟價值。作為繭絲綢生產(chǎn)和出口大國，我國的家蠶繭產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的三分之二左右[1]。縱觀歷史發(fā)展，家蠶在提高人類物質(zhì)文明水平、傳播中國傳統(tǒng)文化以及加強東西方文化交流等方面都做出了重要貢獻。

家蠶作為國際公認的鱗翅目模式昆蟲，在生命科學研究領(lǐng)域也發(fā)揮著重要作用。在家蠶病理研究中，按病原微生物種類不同，將傳染性蠶病分為病毒病、細菌病、真菌病和原蟲病4類。由病毒引起的傳染性蠶病主要有3種：即血液型膿病、中腸型膿病和病毒性軟化病。這3種病毒病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)中危害最大的蠶病，約占總發(fā)病比例的80%，其中由家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear polyhedrosis virus，BmNPV)所引起的家蠶血液型膿病危害最為嚴重[2]。培育對BmNPV侵染具有較高抗性的家蠶品種，是控制該病對蠶業(yè)生產(chǎn)危害最經(jīng)濟有效、安全環(huán)保的手段。多年來，蠶業(yè)科研人員一直致力于篩選抗BmNPV家蠶種質(zhì)資源、發(fā)現(xiàn)抗性基因、闡明抗性分子機制，以期通過傳統(tǒng)常規(guī)育種或現(xiàn)代分子育種手段選育出對BmNPV具有較高抗性的家蠶新品種，減小蠶病危害，提高經(jīng)濟效益。目前，相關(guān)研究已取得了一定進展，育成并在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用了家蠶抗BmNPV品種華康2號[3]、華康3號[4]、野三元(抗)[5]、桂蠶N2[6]等，現(xiàn)將家蠶抗BmNPV品種選育研究進展綜述如下，供同仁參考。

1 家蠶核型多角體病毒

1.1 桿狀病毒簡介

BmNPV屬于桿狀病毒，廣泛存在于節(jié)肢動物中。據(jù)有關(guān)報道顯示，桿狀病毒能感染包括鱗翅目、雙翅目、直翅目、膜翅目等在內(nèi)的7個目的超過600種昆蟲[7]。據(jù)第五屆國際病毒分類委員會(international committee on taxonomy of viruses，ICTV)報告，桿狀病毒分包涵體桿狀病毒亞科和非包涵體桿狀病毒亞科2個亞科[8]。據(jù)第八屆ICTV報告，桿狀病毒分核型多角體病毒(NPV)和顆粒體病毒(GV)2個屬[9]。最新的分類方法將桿狀病毒分為α桿狀病毒屬(鱗翅目核型多角體病毒)、β桿狀病毒屬(鱗翅目顆粒體病毒)、γ桿狀病毒屬(膜翅目核型多角體病毒)、δ桿狀病毒屬(雙翅目核型多角體病毒)4個屬，BmNPV屬于α桿狀病毒屬[10]。依據(jù)囊膜內(nèi)的核衣殼的數(shù)量可以將NPV分為單粒包埋型NPV(SNPVs)和多粒包埋型NPV(MNPVs)2類，BmNPV屬于單粒包埋型NPV[7,11]。

1.2 桿狀病毒作用機制

由BmNPV引發(fā)的家蠶血液型膿病是家蠶飼養(yǎng)過程中常見的危害最嚴重的一種病毒病[12]。BmNPV由含有雙鏈環(huán)狀DNA(dsDNA)的核衣殼和外被囊膜組成[13]。BmNPV主要有2種存在形態(tài)：一是病毒感染初期核衣殼以出芽的方式形成芽生型病毒粒子(budded virus，BV)[14-15]，在宿主細胞中復(fù)制裝配后，釋放到細胞外感染鄰近的細胞；二是在感染宿主的后期生成包埋型病毒粒子(occlusion derived virus，ODV)[14，16]，這些ODV被多角體蛋白包埋形成包涵體(occlusion body，OB)[17]，最終造成家蠶細胞破裂、血淋巴渾濁，引起家蠶發(fā)病死亡。

1.3 桿狀病毒感染家蠶后病毒粒子的侵染途徑

家蠶感染BmNPV的主要途徑是經(jīng)口食下感染，BmNPV包涵體進入中腸后在堿性環(huán)境下釋放病毒粒子[14]。雖然大部分病毒粒子會被家蠶本身的防御反應(yīng)清除，但是仍有一部分會穿過圍食膜(peritrophic membrane，PM)附著在中腸的微絨毛上[18]，進而釋放核衣殼進入中腸細胞并通過核孔進入細胞核，在細胞核中復(fù)制組裝新的核衣殼。在病毒感染初期核衣殼以出芽的方式形成的BV[14-15]釋放到細胞外感染鄰近的細胞，或者釋放到血淋巴中并隨著血淋巴的循環(huán)感染其他組織。病毒感染的后期生成ODV[14，16]，這些ODV在細胞核中聚集形成包涵體[19]，最終導致家蠶細胞破裂、血液渾濁，引起家蠶發(fā)病死亡。

2 家蠶抗BmNPV病國內(nèi)外研究進展

目前，已有許多關(guān)于家蠶與BmNPV感染、抗性的研究，主要研究方向為家蠶基因組學和家蠶蛋白質(zhì)組學，也有學者將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用到家蠶抗BmNPV品種的培育中。

2.1 家蠶對BmNPV抵抗性的遺傳研究

易文仲研究表明家蠶雜交F1、F2代經(jīng)口感染BmNPV后，抵抗性受父本影響較大，有偏父遺傳現(xiàn)象[20]?；奈淞x信[21]實驗結(jié)果顯示，雜交F1代對BmNPV的抵抗性受母本影響較大，后代未見受親本的影響。鲇沢千尋[22]發(fā)現(xiàn)雄體的抵抗性要大于雌體。孟啟智[23]運用對數(shù)濃度-極值模式曲線分析法研究后認為，家蠶對BmNPV經(jīng)口感染后的抵抗性主要受1對位于常染色體上的顯性基因和若干微效基因控制，有偏父遺傳現(xiàn)象，F(xiàn)1雜合體的抗病性有超顯性現(xiàn)象；品種間的抗病性差異明顯，強弱開差達800余倍。陳克平等[24]認為家蠶對BmNPV的抵抗性是受2對以上基因控制的，有偏父遺傳現(xiàn)象。家蠶對BmNPV感染抵抗性有以下幾個特點：一是具有雜種優(yōu)勢，F(xiàn)1代有明顯的超顯性現(xiàn)象，繼代越往后雜種優(yōu)勢逐漸減弱；二是有偏父遺傳現(xiàn)象，且雄體抵抗性大于雌體[24]。因此認為，家蠶對該病的抗性可能主要由1對常染色體上顯性主效基因和位于Z染色體上若干微效基因控制。

2.2 抗BmNPV家蠶品種的調(diào)查

鲇沢千尋[22]和荒武義信[21]分別采用蠶體皮下感染和經(jīng)口感染BmNPV的方式對家蠶進行了BmNPV抵抗性的調(diào)查，認為家蠶不同品種對BmNPV抵抗性有很大差異。我國學者呂鴻聲[25]首先研究了家蠶品種對BmNPV的抗性差異。張遠能等[26]對33個品種進行了抗BmNPV鑒定，發(fā)現(xiàn)了抗性品種與易感品種的抗病能力相差近千倍。陳克平等[27]對中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所保存的344個品種(品系)進行了抗BmNPV鑒定，發(fā)現(xiàn)從化性角度看品種對BmNPV抗性強弱順序為多化>二化>一化，日一化>歐一化>中一化，日二化>中二化。

2.3 抗BmNPV品種選育常規(guī)技術(shù)

家蠶抗病品種作為育種的主要目標之一，是提高家蠶對病原體抵抗能力的主要途徑。進行育種前，必須對家蠶種質(zhì)資源的抗病性及經(jīng)濟性狀進行調(diào)查，掌握具有一定抗病能力或經(jīng)濟性狀突出的家蠶種質(zhì)資源。兼?zhèn)漭^強抗病能力和優(yōu)良經(jīng)濟性狀的家蠶種質(zhì)資源很少，因此選育時一般會選擇飼養(yǎng)表現(xiàn)良好的種質(zhì)資源作為基礎(chǔ)材料，然后通過感染高濃度的BmNPV，存活個體繼代，同時進行經(jīng)濟性狀選擇，經(jīng)過多次添毒繼代后，提高其抗病能力。在傳統(tǒng)抗BmNPV育種工作中，因其存在偏父遺傳現(xiàn)象，一般將具備高度抗BmNPV病的品種作為父本，與經(jīng)濟性狀優(yōu)良的品種進行雜交，F(xiàn)1代與經(jīng)濟性狀優(yōu)良的輪回母本回交，后代飼養(yǎng)時人為感染BmNPV，以不發(fā)病個體繼代，經(jīng)多代選育后，育成具備優(yōu)良經(jīng)濟性狀和較強抗病能力的家蠶品種。

吳福泉等[28]利用兩廣蠶區(qū)生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的強健抗性品種，優(yōu)選8個母種進行6代添食BmNPV選拔試驗，每個品種選取2～3個蛾區(qū)，其中一半添毒，另一半正常飼養(yǎng)，8個母種對BmNPV抗病能力均有不同程度的提高，且經(jīng)濟性狀穩(wěn)定，其中春5品種的發(fā)病率由63%下降到23%，蟲蛹統(tǒng)一生命率從36%提高到76%，累代添食BmNPV選拔效果顯著。

徐安英等[29]選用對BmNPV具有高度耐受性的品種N作為母本，以我國蠶區(qū)推廣較多的實用家蠶品種秋豐、白玉為父本分別進行雜交，F(xiàn)1代與輪回父本秋豐和白玉回交4代(每代添食BmNPV)，然后進行多代自交，純合固定耐受基因并選擇經(jīng)濟性狀，最終育成高抗BmNPV的家蠶新品種秋豐N×白玉N(華康2號)，其對BmNPV多角體的LC50值達到2.033×109個/mL，是秋豐×白玉對BmNPV多角體LC50值的12 115 倍，是菁松×皓月對BmNPV多角體LC50值的10 304倍，抗BmNPV效果非常顯著。

2.4 最新抗BmNPV病品種選育技術(shù)

2.4.1 家蠶抗病分子標記輔助育種研究 分子標記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)是隨著分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術(shù)，它可以從分子水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，從而實現(xiàn)對基因型的直接選擇。由于分子標記輔助選擇方法相對簡單，可以進行早期篩選，因此提高了選擇強度并縮短了世代間隔，從而提高了育種的效率和準確性。

目前，已有多項分子標記技術(shù)應(yīng)用于家蠶基因的研究，并構(gòu)建了幾種家蠶分子標記遺傳圖譜。不斷發(fā)展和完善的分子標記技術(shù)，已經(jīng)在家蠶新品種的選育過程中得到廣泛應(yīng)用，在家蠶抗性品種輔助選育方面也發(fā)揮了重要的作用。

劉曉勇等[30]對含有抗BmNPV病主效基因的家蠶品種NB和高敏感品種306及其近等基因系統(tǒng)BC9等，采用500個RAPD隨機引物分別在各個品系的DNA混合物中進行擴增以篩選分子標記，獲得與家蠶抗BmNPV病有關(guān)的3個分子標記：OPF-072 023、OPJ-131 300、OPM-161 200。

姚勤等[31-32]利用我國家蠶種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)的高抗BmNPV材料NB和敏感材料306，構(gòu)建了3種家蠶抗BmNPV病近等基因系，采用RAPD技術(shù)獲得分子標記，將標記轉(zhuǎn)換成特定序列擴增(sequence characterized amplified region，SCAR)標記，利用SCAR標記輔助家蠶抗BmNPV新品種育種選擇，獲得了家蠶抗BmNPV新品種抗NPV-1。

曹錦如等[33]通過添毒等常規(guī)方法明確育種材料的抗性性狀，對育種材料進行了BmNPV抗性基因連鎖分子標記，進一步明確標記基因與抗性性狀間的遺傳相關(guān)性，并據(jù)此篩選出BmNPV抗性品種“多化N”和敏感性的實用品種“春華”作為育種素材，并從該特定品種“多化N”中獲得了特異性連鎖片段(EU564814)。

2.4.2 抗BmNPV轉(zhuǎn)基因家蠶基因水平的研究 把抗病基因?qū)爰倚Q體內(nèi)培育出抗病品種是轉(zhuǎn)基因家蠶研究中的重要內(nèi)容之一。家蠶轉(zhuǎn)基因育種一般是利用病毒致病基因反義核酸來抑制病毒復(fù)制基因，或?qū)⒒蛑委熀怂峄蚝嗣父咝ЫY(jié)合，對外源致病基因既能阻止其表達，又有切割作用，從而提高家蠶的抵抗力?；蛘咄ㄟ^轉(zhuǎn)基因技術(shù)把相關(guān)的抗病基因?qū)爰倚Q體內(nèi)。

張峰等[34]將含核酶基因的線性化重組質(zhì)粒pGL2Rz用基因槍導入家蠶早期受精卵中(G0代)，孵化率約為80%。檢測G1代5齡家蠶血淋巴的熒光素酶活性，獲得14條熒光素酶表達轉(zhuǎn)基因蠶；并且從G2代開始通過BmNPV攻擊來篩選抗性較高的家蠶進行傳代，在G4代獲得1區(qū)對BmNPV抗性強度比對照組高10.00倍的轉(zhuǎn)基因家蠶。對該區(qū)5齡蠶基因組DNA進行PCR檢測和Southern雜交結(jié)果證明，核酶基因多拷貝地整合在家蠶染色體上，利用RT-PCR能檢測到蛹期核酶的表達。研究結(jié)果表明通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以獲得抗BmNPV的核酶轉(zhuǎn)基因蠶。

家蠶對病害的抵抗性一般受多基因控制，且絕大部分抗性相關(guān)基因在染色體上的位置尚未明確，因此直接進行轉(zhuǎn)基因抗病育種比較困難。近年發(fā)展起來的RNA干涉(RNAi)技術(shù)有望解決這一難題。ISOBE等[35]2004年第1次報道了利用RNAi技術(shù)增強了轉(zhuǎn)基因細胞及家蠶對BmNPV的抗性。利用piggyBac轉(zhuǎn)座子介導獲得表達BmNPV重要的晚期表達因子lef-1的長片段dsRNA的轉(zhuǎn)基因家蠶，在接種BmNPV病毒后72 h，轉(zhuǎn)基因家蠶血淋巴中的病毒DNA水平與對照組相比降低了10%。但是并沒有降低感染BmNPV家蠶的死亡率。

葉秋霞等[36]將帶有BmNPV晚期表達因子基因(lef-1)dsRNA表達盒和新霉素抗性基因(neo)表達盒的轉(zhuǎn)基因載體pigA3-LEF-Neo通過精子介導法導入蠶卵，經(jīng)遺傳霉素(G418)和綠色熒光蛋白(GFP)雙重篩選并結(jié)合分子生物學鑒定，證實獲得了轉(zhuǎn)基因家蠶。對G6代轉(zhuǎn)基因家蠶2齡起蠶接種BmNPV，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因家蠶的死亡率比正常家蠶下降了10～30個百分點，轉(zhuǎn)基因家蠶對BmNPV的抗性有所提高：對接種BmNPV的5齡轉(zhuǎn)基因家蠶A、B系統(tǒng)的定量PCR檢測結(jié)果顯示，2個系統(tǒng)的lef-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別比對照組平均降低了72.00倍和26.50倍，最高下降了104.00倍，進一步表明表達lef-1 dsRNA的轉(zhuǎn)基因家蠶抑制了BmNPVlef-1基因的表達。

2.4.3 抗BmNPV家蠶基因編輯水平的研究 基因編輯是指利用分子生物學的方法，按照人們預(yù)定的目的對生物基因組的特定位點進行特異性的刪除、替換、插入等人工突變，從而獲得特定的基因組序列，進而獲得期望的生物遺傳特異性[37]。目前的基因編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶(ZFN)，類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物因子核酸酶(TALENs)和成簇的、有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR/Cas9)[38]。而CRISPR/Cas9是目前編輯效率最高、載體構(gòu)建最簡單、成本最低的一種方法。

DONG等[39]2016年首次在家蠶細胞中建立了高效病毒誘導型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，用BmNPV誘導型啟動子39 k啟動Cas9蛋白的表達，靶向編輯病毒的極早期基因ie-1，結(jié)果表明靶向編輯BmNPV基因組后，明顯地抑制了BmNPV的增殖復(fù)制，而且由于使用病毒的39 k啟動子啟動Cas9蛋白的表達，也在很大程度上降低了脫靶效率。CHEN等[40]2017年通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)的結(jié)合，構(gòu)建了靶向敲除BmNPV的me53和ie-1基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，同時進行抗BmNPV檢測，其對BmNPV的抗性有了明顯的提高。DONG等[41]2018年通過構(gòu)建單獨的CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因家蠶和sg RNA轉(zhuǎn)基因家蠶，定向地編輯ie-1基因之后，使轉(zhuǎn)基因家蠶對BmNPV的抗性有了顯著的提高，同時對靶位點的編輯效率有了明顯的提高。董非凡[42]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，從BmNPV增殖相關(guān)基因和抗凋亡基因入手，構(gòu)建一個同時敲除BmNPV抗凋亡基因iap2基因和增殖復(fù)制相關(guān)基因orf59的轉(zhuǎn)基因家蠶，對BmNPV多角體的半數(shù)致死劑量(LD50)較對照(非iap2和orf59的轉(zhuǎn)基因家蠶)提高了100.00倍，為培育轉(zhuǎn)基因抗性素材提供了一個新的思路。

2.4.4 抗BmNPV轉(zhuǎn)基因家蠶蛋白質(zhì)組水平的研究 目前，家蠶抗BmNPV的研究主要是在致病機理、傳染途徑、DNA分子標記和轉(zhuǎn)錄水平等方面，家蠶蛋白質(zhì)組水平研究還在剛起步階段。

蔡克亞等[43]利用遺傳學原理，通過雜交和回交的方法建立了家蠶抗BmNPV、感BmNPV以及近等基因品系模型，利用2-D電泳和MALDI TOF/TOF MS質(zhì)譜技術(shù)，從蛋白質(zhì)組水平上研究家蠶對BmNPV的抗性。獲得家蠶BmNPV抗性品系NB、感性品系306、近等基因品系BC8的5齡起蠶血淋巴液蛋白差異表達譜，分別獲得180、190、187個蛋白點，其中80%的蛋白點集中在等電點5～9范圍之內(nèi)。從3塊凝膠上共獲得明顯差異蛋白點12個，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為β-1，3-葡萄糖識別蛋白、酚氧化酶、氨基?；?aminoacylase)、羥脯氨酸異構(gòu)酶、溶酶體硫醇還原酶IP30前體Ⅰ型5種蛋白，其中氨基酰化酶僅出現(xiàn)在抗性品系NB、近等基因品系BC8圖譜中，在感性品系306圖譜中沒有出現(xiàn)，初步推測是與家蠶抗BmNPV相關(guān)的1個重要蛋白，為首次報道。

日本學者PONNUVEL等[44]于2003年從家蠶腸液內(nèi)分離獲得家蠶脂肪酶1(Bmlipase-1)，通過實驗證明其具有很強的抗BmNPV的ODV活性。陳杰[45]通過基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了增量表達病毒抗性蛋白Bmlipase-1的轉(zhuǎn)基因載體，經(jīng)顯微注射成功獲得病毒基因ie1啟動子啟動的Bmlipase-1表達的ie1+lipase-1轉(zhuǎn)基因品系和肌動蛋白A4為啟動子啟動的Bmlipase-1表達的A4+lipase-1轉(zhuǎn)基因品系，經(jīng)基因表達量分析表明，轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的病毒抗性蛋白家蠶保存種對BmNPV的抗性蛋白表達量明顯高于非轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。對轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)進行病毒攻擊測試，結(jié)果顯示相較于非轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)對BmNPV的抗性均呈現(xiàn)不同程度的提高。即通過轉(zhuǎn)基因過量表達Bmlipase-1，獲得的轉(zhuǎn)基因品系對BmNPV的抵抗能力有一定提高。不同家蠶品種對BmNPV的抗性存在非常大的差異[27]，相關(guān)研究顯示Bmlipase-1的表達量與家蠶品種對BmNPV的抗性水平有著一定的關(guān)聯(lián)，即對BmNPV抗性越強的品種其Bmlipase-1的表達量越高[46]。研究結(jié)果表明，內(nèi)源增量表達病毒抗性蛋白也是增強宿主抗性的一種手段，為抗病品種選育提供了一定的參考。

3 展望

鑒于BmNPV病對蠶桑生產(chǎn)危害的嚴重性，人們對該病害的病原類型、侵染途徑、預(yù)防方法、家蠶抗性遺傳規(guī)律等諸多方面進行了大量研究。目前，蠶桑生產(chǎn)上使用的抗BmNPV病品種主要是由傳統(tǒng)方法育成的。分子標記、轉(zhuǎn)基因、基因編輯、內(nèi)源增量表達病毒抗性蛋白等技術(shù)在家蠶抗BmNPV病育種中發(fā)揮重要作用，不僅可以縮短育種周期、提高準確性，在豐富家蠶種質(zhì)資源、減少病害發(fā)生、提高蠶業(yè)經(jīng)濟效益等方面亦具有深遠的意義。

隨著對抗BmNPV病基因、病毒抗性蛋白的深入研究，相關(guān)技術(shù)研究進一步完善，結(jié)合各項研究結(jié)果，將進一步探明家蠶抵御BmNPV侵染最簡單有效的途徑。因此，利用抗BmNPV病基因、病毒抗性蛋白與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合開展抗病育種，將是未來一種更快捷更高效的家蠶育種途徑。