分子生物學(xué)方法在食品微生物檢測中的應(yīng)用

□ 范 鑫 張彥斌 張宏博 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗檢測中心朱葉青 呼和浩特市食品檢驗所 羅海濤 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗檢測中心

食品安全在各個國家都備受重視，對于食品安全的要求十分嚴(yán)格，食品中絕對不能含有損害和威脅人體的物質(zhì)和因素。為了保證社會穩(wěn)定和人體健康，準(zhǔn)確檢測食品中的一些不安全因素，例如細菌、真菌等，并給予快速及時的解決措施，是當(dāng)前各個國家都非常重視的話題，構(gòu)建健康和諧社會，做好食品安全檢測是重大戰(zhàn)略性問題[1]。傳統(tǒng)的微生物檢測方法效率低、步驟多，而且對于生長緩慢和新型的微生物的檢測難度較大，因此需要研究更加快速準(zhǔn)確的檢測方法，而分子生物學(xué)檢測法經(jīng)過實踐證明具有獨特的優(yōu)勢。

1 傳統(tǒng)的食品微生物檢測方法分析

研究表明，傳統(tǒng)可培養(yǎng)微生物僅占環(huán)境總微生物的1%左右，高達99%不可培養(yǎng)微生物才是微生物的主體。依靠培養(yǎng)手段，在生物多樣性上不能反映微生物的真實狀況，傳統(tǒng)的檢測方法以染色法和培養(yǎng)法為主，主要依賴于分離培養(yǎng)和細菌體外培養(yǎng)。傳統(tǒng)微生物檢測方法在檢測時間、可檢測的微生物數(shù)量以及靈敏度等方面存在諸多不足：①樣品培養(yǎng)導(dǎo)致檢測時間長，傳統(tǒng)生物檢測時間幾小時甚至幾天；②鑒定微生物種類有限，準(zhǔn)確度一般；③流程復(fù)雜，尤其是樣本培養(yǎng)和處理，且污染概率高。

分子生物技術(shù)在微生物基因檢測領(lǐng)域正快速崛起，以NGS和臨床質(zhì)譜檢測為主，并具有速度快、通量高、省去樣品培養(yǎng)環(huán)節(jié)、污染風(fēng)險較低、準(zhǔn)確度較高、檢測范圍廣以及試劑耗材相對較少且成本低的優(yōu)點[2]。

2 基于分子生物學(xué)的微生物檢測新技術(shù)

相比傳統(tǒng)方法，微生物基因檢測新技術(shù)有明顯優(yōu)勢。以基因序列多樣性，使用核糖體小亞基RNA將細菌部分序列作為分子標(biāo)簽，以代替對基因組核酸的研究，這種方法主要采用基因探針、熒光定量PCR、基因芯片和熒光原位雜交等方法檢測物種的多樣性。

2.1 熒光原位雜交

直接與經(jīng)過處理的細胞進行雜交，在放射性原位雜交的基礎(chǔ)上取代同位素標(biāo)記，形成了一種熒光標(biāo)劑雜交方法。將帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針導(dǎo)入細胞內(nèi)內(nèi)，使其與細胞內(nèi)的核酸結(jié)合，用熒光顯微鏡進行觀察，檢測帶有雜交熒光標(biāo)記的細胞，通過計算雜交率，定量細菌。對于人工微生物環(huán)境檢測中的不足可以予以彌補，通過純化和擴增步驟，實現(xiàn)對微生物個體的分析，其技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在不同微生物群落之間差異的分析上[3]。

2.2 基因探針檢測方法

基因探針技術(shù)由美國華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院的研究人員創(chuàng)建創(chuàng)建，它是以互補基因為基礎(chǔ)，使序列互補核酸在食品檢測中發(fā)揮作用。近年來基因探針技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測，能夠?qū)χ虏⌒晕⑸镞M行快速靈敏的檢測，基因探針技術(shù)廣泛應(yīng)用在食品微生物檢測中，對于每一種病原體的關(guān)鍵性核酸片段進行制備，通過分離和標(biāo)記，結(jié)合目的核酸序列，使得特定病原體在藥品中被發(fā)現(xiàn)，并用特定的方法進行測定，以此確定樣品中有無特定病原體。核酸探針技術(shù)靈敏性高，具有特異性，而且兼具組織化學(xué)染色的定位性和可見性。因此國外研究者已經(jīng)發(fā)明了多種基因探針檢測技術(shù)，例如對食品中的沙門氏菌進行檢測的基因片段探針，對單核細胞增生李斯特菌進行檢測的自動化酶連接非放射性DNA探針，以及成功鑒定大腸桿菌的獨立基因探針等[4]。

2.3 PCR技術(shù)

模板在數(shù)小時內(nèi)，在引物的引導(dǎo)下，對特定的DNA序列進行復(fù)制，在數(shù)小時內(nèi)進行百萬倍擴增，根據(jù)序列特異性，得到食品致病性微生物檢測結(jié)果，利用檢驗的特異性和靈敏度的優(yōu)勢，快速得出正確的檢驗結(jié)果。常見的方法有普通PCR、巢式PCR、多重PCR以及熒光定量PCR等，經(jīng)過實踐具有指導(dǎo)意義。通過設(shè)計保守區(qū)引物，使得各種細菌間的種系序列的可變性增大，對信息進行分類和鑒別，發(fā)現(xiàn)其明顯差異，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育圖譜，將二者結(jié)合起來，進行細菌的分類和鑒定，能夠快速測定食品中的主體微生物。

2.4 基因芯片技術(shù)

用熒光素在檢測雜交信號上實現(xiàn)對樣品的快速檢測，采用原位合成纖維打印手段進行標(biāo)記樣品的雜交。首先對各種基因進行芯片表面上的處理，通過分析熒光分布和掃描儀定量模式，在對多參數(shù)的微生物序列進行同步分析后，確定檢測樣品中是否存在特定分析微生物，快速進行自動檢驗，通過一次雜交檢測從菌株的水平鑒定微生物，將芯片中的核酸雜交，按照檢測要求進行探針固化，檢測得出食品中的微生物分布，有助于分析總結(jié)有害微生物的特征[5]。

2.5 高通量測序技術(shù)

因其數(shù)字化信號、高數(shù)據(jù)通量、高測序深度和高準(zhǔn)確性等特點，被廣泛應(yīng)用于微生物群落的研究中，能檢測出新的菌株，目前的生物信息學(xué)分析也可以基于16S rDNA的測序，對代謝途徑和微生物群落的基因構(gòu)成進行預(yù)測分析。

2.6 宏基因組學(xué)

高通量測序和生物信息學(xué)分析，是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，科進行功能基因篩選鑒定。宏基因組可提供大量的、無法估計的基因信息，是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，直接提取環(huán)境樣品中的宏基因組及尋找和發(fā)現(xiàn)活性代謝產(chǎn)物和新的功能基因的一種方法。宏基因組技術(shù)路線為：不經(jīng)過分離培養(yǎng)微生物，對環(huán)境中微生物群體總DNA進行提取。宏基因組文庫的構(gòu)建，以測序分析和功能基因篩選為研究手段，了解了微生物群落潛在功能，成為菌群多樣性和功能相結(jié)合的研究工具。

3 結(jié)語

近年來，我國曝光了一系列的食品安全事件，造成了嚴(yán)重的消費者恐慌，導(dǎo)致對食品安全問題的關(guān)注度逐漸提升。微生物污染作為一項嚴(yán)重的食品污染問題，可能導(dǎo)致食物變質(zhì)，引發(fā)食物中毒，為了避免這一現(xiàn)象，應(yīng)采取科學(xué)、合理的方法對食物進行檢測，以保證食物安全。分子生物學(xué)方法與食品病原微生物傳統(tǒng)檢測方法相比具有良好的優(yōu)勢，大大提高了食品微生物檢測水平。