葡萄霜霉病抗性育種研究進(jìn)展

付晴晴，褚燕南，王躍進(jìn)，徐炎*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

葡萄霜霉病（Grape downy mildew）是由葡萄霜霉菌[Plasmopara viticola(Berk. & M. A. Curtis)Berl. & De Toni]引起的典型流行性病害[1]，遍及世界各葡萄產(chǎn)區(qū)，以多雨潮濕地區(qū)發(fā)生普遍[2-3]，是危害葡萄最重要的病害之一。葡萄霜霉菌多侵染葡萄葉片，也可感染新梢、幼嫩果實(shí)等組織，病菌從侵入寄主到發(fā)病僅需3～5 d，在條件適宜情況下，從田間出現(xiàn)中心病株到大面積爆發(fā)只需10～15 d[4-5]。據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）數(shù)據(jù)顯示，中國2018年的葡萄種植面積達(dá)87.5萬 hm2，占世界葡萄種植面積的12%，僅次于西班牙，而葡萄產(chǎn)量居于世界首位[6]。目前，有關(guān)葡萄霜霉病傳入我國的時(shí)間和途徑尚不清楚，但最早的記載出現(xiàn)于1899年。現(xiàn)在霜霉病在我國各葡萄產(chǎn)區(qū)均有分布，以河北和山東發(fā)病最為嚴(yán)重，引起的葡萄減產(chǎn)在一般年份約有10%～20%，而在霜霉病流行年份能達(dá)到50%～80%，甚至絕產(chǎn)[7]，給葡萄生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。在新世界釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)澳大利亞，平均每年因葡萄霜霉菌造成的產(chǎn)業(yè)損失高達(dá)6300萬美元[8]，相當(dāng)于澳大利亞葡萄生產(chǎn)總值的1%[9]。生產(chǎn)上的一些農(nóng)業(yè)手段包括夏季修剪、提高結(jié)果部位、合理負(fù)載量、科學(xué)肥水管理、冬季清園以及采用避雨栽培等措施雖然能在一定程度上減輕葡萄霜霉病的爆發(fā)，但由于化學(xué)藥劑具有見效快、效果顯著、使用方便等特點(diǎn)，所以，目前防治葡萄霜霉病依然過度依賴化學(xué)殺菌劑的使用。歐盟統(tǒng)計(jì)局2007年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在1999—2003年，歐洲葡萄的栽培面積僅占總種植面積的5%，然而卻使用了近60%的殺菌劑[10]。值得注意的是，化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用既危害環(huán)境又耗費(fèi)人力物力，并且化學(xué)農(nóng)藥極易導(dǎo)致霜霉菌產(chǎn)生耐藥性，對(duì)防治病害帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[11-12]。選用抗性品種是葡萄霜霉病防治的重要途徑，也是最為經(jīng)濟(jì)有效的方法[13-14]，而開展葡萄霜霉病的抗性研究及抗病機(jī)理探討，對(duì)指導(dǎo)葡萄抗病育種具有重要意義。本文根據(jù)前人的研究報(bào)道，對(duì)葡萄霜霉菌的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了分析探討。

1 不同野生種葡萄對(duì)霜霉菌的抗性

葡萄不同種類對(duì)霜霉菌表現(xiàn)出較大的抗性差異[15-17]。大量研究表明，歐洲葡萄（V. viniferaL.）栽培種均不抗霜霉病。因此，在葡萄屬的野生種中尋找抗病資源成為各國學(xué)者的研究熱點(diǎn)。原產(chǎn)美洲的圓葉葡萄（Muscadinia rotundifoliaMichx.）雖然對(duì)霜霉菌免疫[18-20]，但遠(yuǎn)緣雜交不親和限制了其進(jìn)一步發(fā)展。中國是葡萄屬野生種的重要起源地之一，擁有豐富的抗病種質(zhì)資源，賀普超等[21]對(duì)我國葡萄野生資源進(jìn)行了收集和保存，并通過田間調(diào)查和接種，以及室內(nèi)離體接種等方法研究了中國野生葡萄對(duì)霜霉病的抗性。結(jié)果表明，對(duì)葡萄霜霉病的抗性在不同株系間存在顯著差異，其中復(fù)葉葡萄‘留壩-8’（V.piasezkii accessionLiuba-8）、瘤枝葡萄‘嵐皋-5’（V.davidiivar.Cyanocarpa accessionLangao-5）為高抗葡萄霜霉病株系；華東葡萄‘白河-35-1’（V. pseudoreticulata accessionBaihe-35-1）為抗霜霉病株系[15,21-22]。Liu等[23]和Yin等[24]通過苯胺藍(lán)和3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobezidin，DAB）染色等方法發(fā)現(xiàn)與歐洲葡萄‘黑比諾’相比，高抗霜霉病的‘留壩-8’和‘嵐皋-5’菌絲生長(zhǎng)緩慢，孢囊梗和孢子囊的萌發(fā)量較少，侵染位點(diǎn)周圍有大量的胼胝質(zhì)沉積和H2O2的積累，進(jìn)一步驗(yàn)證了前期賀普超等人的研究結(jié)果。原產(chǎn)于東亞的山葡萄對(duì)霜霉菌抗性也表現(xiàn)出明顯差異[25]，通過葉圓盤接種試驗(yàn)表明，山葡萄‘左山二’（V. amurensis Rupr. cv. Zuoshan-2）對(duì)葡萄霜霉菌有一定抗性，而山歐雜交種‘左優(yōu)紅’表現(xiàn)易感霜霉菌[26]。

2 葡萄對(duì)霜霉菌抗性機(jī)理

2.1 植物-病原菌互作機(jī)理

植物病原菌進(jìn)化出多種策略以侵染寄主，例如粘附于植物表面、消除或逃避植物響應(yīng)感染產(chǎn)生的防御分子以達(dá)到侵染目的[27]。同時(shí)，植物進(jìn)化出精密的防御系統(tǒng)，從而識(shí)別病原菌分子并產(chǎn)生防御反應(yīng)。植物具有不同的組成型防御機(jī)制，如細(xì)胞壁和角質(zhì)層作為物理屏障以逃避病原菌入侵[28-29]。一旦植物的結(jié)構(gòu)屏障被破壞，植物便通過誘導(dǎo)防御反應(yīng)防止病原菌進(jìn)一步入侵[30]。

植物已經(jīng)進(jìn)化出兩層防御系統(tǒng)：首先，通過寄主細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（pPRR）、識(shí)別微生物相關(guān)分子模式（MAMP）或病原菌相關(guān)的分子模式（ PAMP），即PAMP-激發(fā)的免疫（PTI）或MAMP-激發(fā)的免疫（MTI）[31-32]。PTI啟動(dòng)一系列基礎(chǔ)防御，包括活性氧（ROS）積累以及胼胝質(zhì)沉積來增強(qiáng)細(xì)胞壁[33-34]。然而，一些病原菌進(jìn)一步進(jìn)化以釋放抑制PTI的效應(yīng)因子，破壞寄主免疫反應(yīng)從而促進(jìn)病原菌定殖[35-36]。在宿主與病原菌的進(jìn)化斗爭(zhēng)中，植物進(jìn)化出第二層防御系統(tǒng)，通過細(xì)胞內(nèi)受體識(shí)別胞內(nèi)效應(yīng)因子，觸發(fā)效應(yīng)因子激發(fā)的免疫（ETI）反應(yīng)[37-38]。細(xì)胞內(nèi)受體主要是富含核苷酸結(jié)合-亮氨酸重復(fù)（NB-LRR）的R蛋白，通過復(fù)雜的機(jī)制直接或間接識(shí)別病原菌效應(yīng)因子[37]。R蛋白一旦被效應(yīng)因子激活，便可引起強(qiáng)烈的防御反應(yīng)，包括ROS快速爆發(fā)、水楊酸積累、侵染位點(diǎn)的過敏反應(yīng)（HS）及病程相關(guān)蛋白（PR）基因上調(diào)表達(dá)。ETI啟動(dòng)與復(fù)雜防御信號(hào)傳導(dǎo)途徑網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，導(dǎo)致防御性細(xì)胞反應(yīng)和大規(guī)模轉(zhuǎn)錄重編程事件[39]。

2.2 葡萄抗霜霉病基因功能分析

相較于歐洲葡萄，美洲葡萄及中國野生葡萄具有更高的葡萄霜霉菌抗性?；诖?，國內(nèi)外學(xué)者利用組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等方法研究了葡萄-葡萄霜霉菌互作關(guān)系，揭示了葡萄抗霜霉病作用機(jī)制。

植物通常利用多種因子相互作用共同抵抗病原菌入侵。大量研究發(fā)現(xiàn)，葡萄葉片和漿果中的白藜蘆醇、紫檀芪、ε-和δ-葡萄素能夠抑制葡萄霜霉菌生長(zhǎng)[40-43]。另外，木質(zhì)素和萜類化合物也在抗葡萄霜霉病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[44-46]。

近年來，轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組學(xué)的出現(xiàn)加速了葡萄與葡萄霜霉菌互作的研究。Figueiredo等[47]通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn)，抗病葡萄中編碼枯草桿菌蛋白酶、苯丙氨酸裂解酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、類WD-重復(fù)蛋白和J2P基因表達(dá)上調(diào)，以及肌醇和咖啡酸的積累。接種葡萄霜霉菌的山葡萄‘左山-1’（V. amurensisRupr. cv. Zuoshan-1）已通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定出一系列可能引起寄主抗性的基因和通路，這些基因包括CHI4D、TL3、PR10、CYSP、ERF4、STS5、THX、SHM1、HypP、GLO、ClpP等，涉及的途徑與核糖體結(jié)構(gòu)、光合作用和糖類代謝等有關(guān)[48]。

Marianna等[49]使用Combimatrix微陣列芯片技術(shù)比較了霜霉菌侵染后的美洲種河岸葡萄（V. ripara）與歐洲葡萄（V. vinifera）初期轉(zhuǎn)錄本變化，挖掘出的一些候選抗性基因涉及病程相關(guān)蛋白、苯丙烷類化合物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)組分和茉莉酸等。Malacarne等[50]進(jìn)行了葡萄種群的代謝和轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)抗病葡萄中積累反式-白藜蘆醇、反式-白藜蘆醇苷、反式-紫檀芪和多達(dá)13種不同葡萄素，以及參與特異轉(zhuǎn)錄防御反應(yīng)、光合作用、初級(jí)和次級(jí)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和運(yùn)輸?shù)然颉Ｉ鲜銎咸雅c霜霉菌的互作均基于不同抗病葡萄與混合霜霉菌。Li等[51]分析兩種葡萄霜霉菌分離菌與葡萄的互作，發(fā)現(xiàn)在非親和互作中抗性相關(guān)基因、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因、激素相關(guān)基因、病程相關(guān)蛋白基因以及與防御相關(guān)代謝物合成相關(guān)基因，如苯丙烷類/芪類/類黃酮合成基因在感染早期表達(dá)更高。Xu等[52]通過蛋白質(zhì)組分析表明，在霜霉菌侵染后抗病葡萄中通過下調(diào)表達(dá)光合相關(guān)蛋白和ATP合成酶來限制病原菌生長(zhǎng)，而上調(diào)表達(dá)PR10蛋白來限制葡萄霜霉菌侵染范圍。Nascimento-Gavioli等[53]研究表明，含有Rpv1和Rpv3基因位點(diǎn)的葡萄對(duì)霜霉菌的抗性反應(yīng)主要涉及氧化還原和能量代謝，尤其是L-抗壞血酸降解途徑。Ma等[54]研究表明，葡萄霜霉菌入侵葡萄葉片后，VpPR10.1與VvVDAC3蛋白相互作用，增大線粒體膜孔通道，細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，激活Metacaspase基因表達(dá)，誘導(dǎo)病原菌入侵部位細(xì)胞死亡，抑制病原菌生長(zhǎng)，阻止葡萄霜霉菌的進(jìn)一步侵染。

3 葡萄霜霉菌效應(yīng)因子致病機(jī)理

細(xì)菌、真菌或卵菌等病原菌對(duì)植物的侵染依賴于一種稱為效應(yīng)因子的致病性因子，這種效應(yīng)因子能分泌效應(yīng)蛋白改變宿主的新陳代謝，以達(dá)到成功侵染寄主的目的[55]。因此，研究葡萄霜霉菌效應(yīng)因子致病機(jī)理，探究葡萄-病原卵菌互作的分子機(jī)制對(duì)抗病育種具有重要的意義。科學(xué)家們通過轉(zhuǎn)錄組和全基因組測(cè)序手段獲得了大量的候選效應(yīng)因子，但大多數(shù)的效應(yīng)因子作用機(jī)制尚不清楚，尤其對(duì)葡萄霜霉菌效應(yīng)蛋白的研究還處于起步階段。葡萄霜霉菌效應(yīng)蛋白主要包括兩類：一類是具有RxLR基序的效應(yīng)因子，另一類是類似于RxLR的Crinkler（Crinkling and necrosis protein，CRN）效應(yīng)因子。

3.1 葡萄霜霉菌RxLR類效應(yīng)因子

RxLR類效應(yīng)因子是根據(jù)位于效應(yīng)蛋白的N-末端區(qū)域保守的RxLR（Arg-X-Leu-Arg）序列以及其下游5～25個(gè)氨基酸的dEER（Glu- Glu-Arg）基序命名[56-57]。RxLR基序可能負(fù)責(zé)將效應(yīng)蛋白從卵菌和真菌轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞內(nèi)[58-59]。

近幾年，有關(guān)葡萄霜霉菌RxLR類效應(yīng)因子的研究進(jìn)展迅速。Mestre等[60]首次通過葡萄霜霉菌萌發(fā)的游動(dòng)孢子構(gòu)建了表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）文庫，并從中篩選出26個(gè)特異表達(dá)的分泌蛋白，其中有2個(gè)RxLR-dEER效應(yīng)蛋白，通過半定量PCR分析發(fā)現(xiàn)在侵染早期有高表達(dá)。Yin等[61]對(duì)“ZJ-1-1”“JL-7-2”和“CSRIO-L-2”三個(gè)葡萄霜霉菌小種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了3萬多個(gè)霜霉菌基因受到誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步鑒定了51個(gè)RxLR類效應(yīng)蛋白，并且發(fā)現(xiàn)這些效應(yīng)蛋白均能抑制由BAX和INF1引起的細(xì)胞死亡。隨后，Mestre等[62]又通過平行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法挖掘到50個(gè)RxLR類效應(yīng)蛋白。Xiang等[63]對(duì)克隆到的23個(gè)RxLR效應(yīng)因子進(jìn)行本氏煙草瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，只有PvRxLR16可以引起煙草葉片細(xì)胞死亡，17個(gè)可以完全抑制不同激發(fā)子誘導(dǎo)的煙草葉片細(xì)胞死亡，5個(gè)部分抑制細(xì)胞死亡，表明葡萄霜霉菌能夠通過分泌RxLR效應(yīng)因子進(jìn)而抑制PTI、ETI和其他類型的免疫反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PvRxLR16存在W/Y/L基序和一個(gè)預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)，點(diǎn)突變糖基化位點(diǎn)后不能引起細(xì)胞壞死，病毒誘導(dǎo)的基因沉默發(fā)現(xiàn)PvRxLR16功能依賴于SGT1、Hsp90和RAR1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而不是Serk3/Bak1[64]。意大利的Brilli等[65]通過全基因組測(cè)序，從“PvitFEM01”葡萄霜霉菌數(shù)據(jù)庫中鑒定了58個(gè)候選RxLR效應(yīng)因子，其中一個(gè)編號(hào)為PVITv1008311效應(yīng)因子能夠引起河岸葡萄葉片的HR反應(yīng)，而在歐亞種葡萄中未出現(xiàn)防衛(wèi)反應(yīng)引起的細(xì)胞壞死。Lan等[66]的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄霜霉菌效應(yīng)因子PvRxLR131通過靶向植物受體樣激酶抑制劑BKI1抑制植物免疫以促進(jìn)病原菌侵染，在本氏煙草中沉默NBBKI1，PvRxLR131的毒性喪失，說明PvRxLR131效應(yīng)因子的活性是由BKI1介導(dǎo)的；PvRxLR131-轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出BKI1過表達(dá)的的矮化表型，抑制了油菜素內(nèi)酯（BR）和ER（ERECTA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3.2 葡萄霜霉菌CRN效應(yīng)因子

CRN蛋白家族最初在致病疫霉中被鑒定，并根據(jù)其分泌蛋白在植物中異位表達(dá)所呈現(xiàn)的特征性葉片皺縮而命名。CRN效應(yīng)蛋白在植物致病卵菌和共生真菌中普遍存在，是胞內(nèi)效應(yīng)因子的第二大類效應(yīng)蛋白[67]。與RxLR蛋白類似，CRN蛋白家族中的成員也是模塊分子，包含信號(hào)肽，保守的N末端氨基酸基序：LXLFLAK，其后是保守的DWL結(jié)構(gòu)域和HVLVVVP基序以及高度多樣化的C末端區(qū)域，并且可能通過N-和C-末端區(qū)域的重組而發(fā)生變異[68-69]。

目前，關(guān)于葡萄霜霉菌CRN效應(yīng)因子的報(bào)道較少。2016年，Mestre等通過葡萄霜霉菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫外挖掘到60個(gè)CRN效應(yīng)蛋白[62]。Brilli等[65]從葡萄霜霉菌“PvitFEM01”的全基因組測(cè)序結(jié)果中挖掘到58個(gè)CRN效應(yīng)蛋白，qRT-PCR結(jié)果顯示其受葡萄霜霉菌誘導(dǎo)表達(dá)。到目前為止，關(guān)于葡萄霜霉菌CRN效應(yīng)因子的功能等研究還未見報(bào)道。

4 分子標(biāo)記輔助抗霜霉病育種

長(zhǎng)久以來，培育優(yōu)質(zhì)高抗的新品種一直是葡萄育種工作者的研究目標(biāo)。利用分子標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)是葡萄抗病分子育種的重要手段，其目的是將不同的抗性位點(diǎn)結(jié)合起來，以獲得持久的抗性。利用分子標(biāo)記對(duì)抗性基因進(jìn)行標(biāo)記，并了解其功能，是培育持久抗性品種的關(guān)鍵[70]。

葡萄霜霉菌屬于微效多基因控制的數(shù)量性狀[71]，中國野生種葡萄存在抗葡萄霜霉病的主效基因[72]，利用高抗的中國野生種葡萄與優(yōu)質(zhì)的歐洲種葡萄雜交而培育抗霜霉病品種是育種工作的重要研究任務(wù)。近十幾年來，分子標(biāo)記輔助育種取得了很大的進(jìn)展。羅素蘭等[73]利用Wizard DNA Clean-up System純化回收抗葡萄霜霉病主效基因連鎖的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記OPO 06-1500，并進(jìn)行序列分析，為抗病雜種早期鑒定、DNA探針合成及獲得抗霜霉病基因提供依據(jù)。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記因其可靠性高、穩(wěn)定性好、成本低等特點(diǎn)，在遺傳定位、種質(zhì)鑒定、標(biāo)記輔助選擇等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，是理想的分子遺傳標(biāo)記。隨著基因組測(cè)序的快速發(fā)展，廣泛分布在葡萄基因組中的高度多態(tài)性SSR分子標(biāo)記已被應(yīng)用到種質(zhì)資源遺傳連鎖分析和數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位[74-75]。葡萄霜霉菌的數(shù)量性狀位點(diǎn)已經(jīng)被鑒定，并且獲得了抗葡萄霜霉病性狀的基于種群分離的分子圖譜，并將這些抗霜霉病的QTLs命名為Rpv（Resistance toP. viticola）。到目前為止，已經(jīng)在4、5、6、7、8、9、11、12、14、17和18號(hào)染色體上鑒定出27個(gè)位點(diǎn)（Rpv1-Rpv27），它們?cè)诓煌倪z傳背景下賦予對(duì)葡萄霜霉病的抗性[76-79]?；诖耍琙hao等[80]選擇30個(gè)SSRs和抗性基因類似物（RGAS）標(biāo)記，對(duì)120個(gè)葡萄野生種質(zhì)資源的霜霉病抗性進(jìn)行了定量分析，獲得一批對(duì)葡萄霜霉菌高抗的野生葡萄株系（如云南元謀-2、云南-2、木札嶺-3等）。

5 展望

綜上所述，葡萄抗霜霉病屬于多基因控制，有多種組分參與抗病性，野生抗病葡萄種質(zhì)資源抗病作用機(jī)制還不清楚，目前利用抗病種質(zhì)通過常規(guī)雜交育種仍然是培育抗病品種的主要途徑。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的葡萄和病原菌特征基因組被揭示，更多的抗性基因被發(fā)掘和應(yīng)用在遺傳育種中。一方面，挖掘NBS-LRR抗病基因通過轉(zhuǎn)基因或過表達(dá)基因顯著提高了植物的抗病性。目前，葡萄中少數(shù)NBS-LRR基因已被克隆，然而缺少深入研究。葡萄NBS-LRR蛋白不同結(jié)構(gòu)域與病原菌的效應(yīng)蛋白是如何相互作用的？在親和與非親和互作中NBS-LRR蛋白起作用的差異是什么？這些問題的解決對(duì)葡萄NBS-LRR基因的利用具有重要的意義。另一方面，小RNA在葡萄抗病中發(fā)揮重要作用，通過對(duì)小RNA的調(diào)控可以實(shí)現(xiàn)葡萄抗病性的提高，不同葡萄的病原真菌誘導(dǎo)的相同小RNA的表達(dá)不同，這可能與葡萄的遺傳、生長(zhǎng)階段以及R基因的存在與否有關(guān)。因此，通過反向遺傳學(xué)方法對(duì)單個(gè)小RNA及其靶基因在抗病遺傳育種中的有效應(yīng)用將成為今后研究的重點(diǎn)。最后，感病基因（S）突變能提高果樹抗病性而成為果樹遺傳育種的目標(biāo)。S基因突變?cè)谂嘤龔V譜而持久抗性品種中具有很好的應(yīng)用前景。S基因是病原菌-寄主間親和互作的決定因子，在遺傳育種中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，隨著基因組編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，S基因應(yīng)用的前景必將越來越廣闊。