高效液相色譜法在白酒分析中的應用

安明哲，廖勤儉，李楊華，羅 珠

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，以下簡稱HPLC）是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。白酒的分析檢測不僅可以幫助人們認識白酒，在食品安全中也起著至關重要的作用，比如重金屬、塑化劑等物質的含量在酒類行業(yè)中有嚴格的要求，這就要求檢測手段必須具有很高的精密度。HPLC在白酒中的運用時間長，方法成熟，已被廣泛運用在白酒的醇類、酯類等物質的檢測中。本文總結了近年來HPLC在白酒中的分析檢測運用，以提供白酒中微量物質檢測手段的參考。

1 HPLC在甜味劑分析中的應用

在白酒中加入甜味劑以增加白酒的甜味和回甜感以改善口感，成為了許多不法生產商的潛規(guī)則。廣泛應用的人工合成甜味劑主要包括甜蜜素、阿斯巴甜、糖精納等，甜味劑在各種香型的白酒國家標準中禁止添加[1-4]。食品行業(yè)中檢測甜味劑的方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法和離子色譜法等，最新食品安全國家標準GB 5009.247—2016規(guī)定了食品中紐甜測定的高效液相色譜法[5]。其前處理過程包括混合提取液提取、固相萃取柱凈化、氮吹濃縮等步驟。

考慮到國標提供的食品中紐甜測定方法的復雜性，劉石雪等[6]對高效液相色譜法測定白酒中紐甜含量的各個影響因素進行了探究，優(yōu)化了實驗條件。最后采用Agilent C18色譜柱（5μm,150 mm×4.6 mm），流動相為乙腈-離子對試劑緩沖液，紫外檢測器波長210 nm，柱溫30℃，流速1 mL/min測定白酒中的甜味劑。此方法中，紐甜濃度在0.16～25μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，檢出限0.06μg/mL，加標回收率在93.75%～98.13%之間。實驗結果表明，此方法分離度較好，操作穩(wěn)定，數據準確，適用于白酒中紐甜的檢測。馬雪豐等[7]研究建立了同時測定白酒中6種甜味劑安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、甜菊糖苷、紐甜、阿力甜的高效液相色譜分析方法。從樣品前處理方法、檢測波長、流動相梯度的不同條件的選擇，最終確定以ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm,5μm）為色譜柱，乙腈-乙酸銨（20 mmol/L）為流動相進行梯度洗脫；采用外標法進行定量分析。6種甜味劑能在25 min內完成分離，在5～100μg/mL范圍內質量濃度與峰面積具有良好的線性關系（相關系數＞0.9999）。該方法的檢出限低，在3個加標水平下，樣品平均回收率在87.0%～103.1%，相對標準偏差＜3%。該方法簡便、快捷、準確，可用于白酒中6種甜味劑的同時測定。

優(yōu)化白酒中甜味劑高效液相色譜的檢測方法，可以為精確測定微量甜味劑提供可靠有效的檢測保障。

2 HPLC在酸類化合物分析中的應用

酸類化合物是酒的重要風味物質，白酒中的有機酸對酒的性質有著較大的影響，其種類和數量決定著白酒的品質和口感。酸量少，酒味淡，后味短；酸量大，酸味露頭，酒味粗糙。適量的酸可對酒起緩沖作用，并在貯存過程中能緩慢地形成酯。酸對酒的甜度也有影響，太酸的酒使酒的“回甜”減弱。優(yōu)質白酒的酸含量較高，一般高于普通白酒1～2倍。因此，酸的含量適中對于白酒的質量起著舉足輕重的作用，對酸類化合物的準確定性和定量也成為白酒行業(yè)中重要的課題。白酒中酸類物質的分析方法主要有氣相色譜法、毛細管電泳法、離子色譜法、高效液相色譜法等。

劉露等[8]利用高效液相色譜法分析白酒中的琥珀酸，色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm×1.7μm）；流動相為0.02 mol/L KH2PO4，pH2.3，用0.22μm濾膜過濾；檢測波長210 nm；柱溫箱30℃；流動相流速：0.2 mL/min；進樣量：10μL。結果顯示，保留時間為2.1 min，線性相關系數R2=0.999，精密度為1.17%，加標回收率在89.0%～101.8%之間，滿足分析方法要求，優(yōu)化后的方法樣品前處理方式簡單，分析樣品時間短，便捷高效，能夠較好地對白酒中琥珀酸定性定量分析。方毅菲[9]首次利用高效液相色譜分析豉香型白酒中的二元酸，采用的方法是DM-2大孔吸附樹脂或等效大孔吸附樹脂提純、Ultimate AQ-C18色譜柱、梯度洗脫、紫外檢測器進行二元酸的液相色譜分析和外標法定量等技術的結合，結果顯示，二元酸的線性范圍為0～80 mg/L，R＞0.999，RSD＜3%，樣品回收率為100%±5%。余劍霞[10]利用高效液相色譜法測定豉香型白酒中微量的高級脂肪酸，測得亞麻酸、肉豆蔻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸的相對標準偏差分別為0.84%、0.42%、0.42%、0.77%、0.22%和3.07%，回收率為91.4%～105.5%，線性范圍為0～50 mg/L，r≥0.99954。王芳等[11]建立了利用高效液相色譜儀同時檢測乳酸、乙酸、丁酸、己酸的方法；馮向東[12]建立了高效液相色譜法測定白酒中乳酸和乙酸含量的方法；李斌等[13]建立了高效液相色譜法測定濃香型白酒中乳酸含量的方法；張寶玉[14]建立了高效液相色譜法測定酒醅中乳酸含量的方法；魏志陽等[15]對高效液相色譜法（HPLC）測定清香類酒醅中主要酸類物質的方法進行了研究，通過對流動相、流速及酒醅中主要酸類物質提取條件（乙醇濃度、提取時間）的優(yōu)化，建立了HPLC同時測定酒醅中乳酸和乙酸的方法。莊俊鈺等[16]采用活性炭(ZS-207)凈化法前處理白酒樣品測定了豉香型白酒中的乳酸含量，此方法簡單易操作，凈化效果好。

酸類物質是白酒中最重要的微量物質成分之一，精確地分析其成分可以為控制白酒質量提供依據。

3 HPLC在酯類化合物分析中的應用

白酒原糧中含有大量的蛋白質，蛋白質水解后生成氨基酸，經過發(fā)酵或者糖化作用生成大量的醇類化合物，醇類化合物與有機酸在酯化反應的作用下合成多種酯類化合物，使白酒具有獨特的香味[17]。

徐靜[18]利用五糧液成品酒作為樣本，選擇固相微萃取作為前處理方法，采用直接進樣法，建立了乳酸乙酯、丙酸乙酯和己酸乙酯的液相色譜分析方法，該方法流動相體系簡單，無需前處理，方便快捷，通過與氣相色譜方法的實驗結果對比，建立的高效液相色譜法準確、靈敏、快速。張房宇[19]建立了反相高效液相色譜法同時測定米香型白酒中乳酸乙酯、乙酸乙酯的方法，酒樣無需任何處理直接入樣。相關系數分別為r=0.99986和r=0.99979；樣品濃度采用外標法測定，回收率分別為98.5%～101.9%和98.1%～101.7%；最低檢出質量濃度分別為0.34 mg/L和0.44 mg/L；該法具有準確度高、靈敏度高、重現性好等優(yōu)點。魏志陽等[15]通過對流動相、流速及酒醅中主要酯類物質提取條件（乙醇濃度、提取時間）的優(yōu)化，建立了HPLC同時測定酒醅中乳酸乙酯和乙酸乙酯的方法。王群等[20]建立了高效液相色譜法同時測定芝麻香型白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯四大酯類的方法，酒樣不需要繁瑣的處理，經過濾膜過濾后即可直接進樣。

4 HPLC在吡嗪類化合物分析中的應用

吡嗪類化合物是一類含1，4-二氮雜苯母環(huán)化合物的總稱，廣泛存在于自然和發(fā)酵食品中，具有類似于炒堅果、烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對其他香味有顯著的烘托和疊加作用。四甲基吡嗪（又稱TTMP）是一種重要的吡嗪化合物，其測定方法有氣相色譜法，液相色譜法和氣相色譜-質譜聯(lián)用法。

司冠儒等[21]利用HPLC快速檢測芝麻香型白酒中TTMP，以甲醇∶水（v/v）=35∶65作為流動相，選用phenomenex Gemini C18柱，在278 nm波長下檢測。結果表明，樣品回收率為94.67%～100.33%，相對標準偏差為3.29%～1.77%。此方法操作簡便，具有較好的準確性和重復性。司冠儒等[22]對比了氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜-質譜聯(lián)用法檢測芝麻香型白酒中TTMP的方法，并對3種方法檢測TTMP的回收率和精密度進行了研究。結果顯示，3種方法的回收率和精密度都滿足檢測的要求。但液相色譜法的優(yōu)勢明顯，TTMP響應較高，出峰前后沒有其他風味物質的干擾，且樣品無需前處理直接進樣，操作簡便，對儀器設備和技術人員的素質要求較低，便于推廣。

5 HPLC在有害物質分析中的應用

5.1 HPLC在塑化劑分析中的應用

隨著白酒行業(yè)中“塑化劑事件”的曝光，人們開始關注白酒塑化劑的安全問題。塑化劑（增塑劑）是指鄰苯二甲酸酯類物質（phthalicacid esters,PAEs），是一種高分子材料助劑，被廣泛應用于食品接觸材料中。塑化劑揮發(fā)性低，穩(wěn)定性高，易溶于有機溶劑，屬干擾生物體內分泌的化學物質[23]，對人體極其有害。白酒中塑化劑的來源包括原料中、生產加工過程中的塑料容器、運輸、存儲過程中的各個因素和非法添加等[24]。蔡英翔等[25]利用HPLC色譜分析法法測定白酒中的6種鄰苯二甲酸酯類物質，檢出限低，加標回收率好。郭麗萍等[26]采用高效液相色譜大體積進樣法測定白酒中7種鄰苯二甲酸酯類物質，方法簡便，效果好。曹江平[27]建立了利用分散液液微萃取-高效液相色譜法測定白酒中的酞酸酯含量的方法。

5.2 HPLC在氨基甲酸乙酯分析中的應用

氨基甲酸乙酯（EC）又名尿烷，是一種產生于發(fā)酵食品和飲料酒中的化合物，主要是在發(fā)酵、蒸餾和貯存時形成。20世紀初期，EC曾用于麻醉劑，到20世紀40年代，研究者發(fā)現EC具有致癌性。1974年，世界衛(wèi)生組織（WHO）的國際癌癥研究所（IARC）把EC定為2B類致癌物，隨后又于2007年3月將其由2B類致癌物提升為2A類致癌物，即對動物有致癌作用，對人類可能有致癌作用[28]。

肖美蘭等[28]采用高效液相色譜技術檢測特香型白酒中氨基甲酸乙酯（EC）的含量，研究了不同發(fā)酵周期生產的基酒中EC的含量。

6 結論

高效液相色譜作為白酒分析中常用的一種儀器設備，除能夠準確地分析白酒中的甜味劑、酸類、酯類和塑化劑外，還可以分析白酒中其他物質。尋思穎等[29]利用酚類物質的熒光特性和手性拆分劑β-環(huán)糊精拆分重疊峰，建立帶熒光檢測-高效液相色譜儀法測定醬香型白酒中10種揮發(fā)性酚類物質含量的方法。陳清艷等[30]通過對白酒中酪醇的高效液相色譜分析方法中檢測波長和流動相進行研究，建立了相應的檢測方法。王春利等[31]建立了白酒中8種生物胺殘留的高效液相色譜分析方法。白酒中的微量物質眾多，各種類型的微量物質組成了不同香型白酒的獨特風味。建立準確、操作簡便、靈敏度高的檢測方法，對于提高白酒產品質量、保障白酒安全、協(xié)助政府加強酒類市場監(jiān)管方面具有重要意義。