TMPRSS2-ETS融合基因在前列腺導(dǎo)管內(nèi)癌診斷中的應(yīng)用

丘佳明,姚文英,王曉燕,魏 煒,林小星,蔡為民,盛仁明

(1.常熟市第二人民醫(yī)院 病理科,江蘇 常熟215500；2.常熟市第一人民醫(yī)院 病理科)

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤。近年來(lái)隨著血清PSA篩查和前列腺穿刺活檢技術(shù)的完善,前列腺癌及其癌前病變的檢出率越來(lái)越高[1]。WHO(2016)泌尿系統(tǒng)和男性生殖器官腫瘤分類中明確列出了前列腺導(dǎo)管內(nèi)癌(IDC-P)這一新的組織類型[2],而它與高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤 (HGPIN)、前列腺浸潤(rùn)性篩狀癌和前列腺導(dǎo)管腺癌均具有相似的鏡下結(jié)構(gòu)卻有不同的臨床意義[3]。免疫組化方法檢測(cè)雞尾酒抗體(P504s+CK34βE12+P63)為目前較常應(yīng)用于前列腺癌的鑒別診斷方法,但在實(shí)際臨床工作中,經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)穿刺活檢較小、較破碎的組織,極易出現(xiàn)鑒別診斷困難,而且其中IDC-P與HGPIN免疫表型特點(diǎn)相近,免疫組化檢測(cè)對(duì)二者鑒別幫助不大[3]。

跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)基因與ETS轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員的融合,具有前列腺特異性,并在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。ETS轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員包括ERG、ETV1、ETV4這三種基因,他們與TMPRSS2基因的融合,目前認(rèn)為是前列腺癌中常見的基因突變。本文采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)TMPRSS2-ETS融合基因在IDC-P、HGPIN、浸潤(rùn)性篩狀癌和導(dǎo)管腺癌中的表達(dá),并以良性前列腺增生和正常前列腺組織作為對(duì)照,以期為它們的診斷提供幫助。同時(shí)采用免疫組化方法標(biāo)記雞尾酒抗體在它們中的表達(dá),比較FISH與免疫組化在前列腺疾病診斷中的作用,為解決前列腺疾病診斷中的難題提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2017年12月送檢至我科和常熟市第一人民醫(yī)院病理科的前列腺蠟塊標(biāo)本及其病理切片,根據(jù)WHO(2016)泌尿系統(tǒng)和男性生殖器官腫瘤分類中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2],復(fù)習(xí)病理切片,選取其中腫瘤成分較多的IDC-P、HGPIN、浸潤(rùn)性篩狀癌和導(dǎo)管腺癌各40例,以及良性前列腺增生和正常前列腺組織各20例作為對(duì)照。

1.2 制備組織芯片

首先對(duì)已篩選的病理切片進(jìn)行觀察,然后在顯微鏡下選取代表性區(qū)域,用筆在相應(yīng)供體蠟塊的相應(yīng)位置上標(biāo)記取材部位。另外制備空白蠟塊作為受體蠟塊。應(yīng)用打孔針取標(biāo)記組織,放入受體蠟塊上對(duì)應(yīng)的小洞內(nèi)。每個(gè)芯片40個(gè)位點(diǎn),間距為0.2厘米。病變組織按照類別制成五份組織芯片,分別為IDC-P、HGPIN、浸潤(rùn)性篩狀癌和導(dǎo)管腺癌各一份,以及良性前列腺增生加正常前列腺組織一份。

1.3 試劑

FISH檢測(cè)所需ERG、TMPRSS2、ETV1、ETV4基因異常檢測(cè)試劑盒(F.01011-01)購(gòu)自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司,包括ERG斷裂探針、TMPRSS2-ETV1融合探針和TMPRSS2-ETV4融合探針。免疫組化檢測(cè)所需前列腺癌雙染試劑盒(DS-0106)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,包括P504s、P63和CK34βE12這三個(gè)抗體。

1.4 FISH檢測(cè)

取制備好的組織芯片,常規(guī)切片,厚為4微米,放入70℃烘箱內(nèi)1小時(shí),脫蠟采用二甲苯兩缸各5分鐘,脫水采用無(wú)水乙醇兩缸各5分鐘,然后室溫風(fēng)干。接著,先后浸入煮沸的去離子水中40分鐘,37℃蛋白酶K溶液中20分鐘,用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行漂洗,梯度酒精(70%、85%、100%)脫水,室溫風(fēng)干。每張切片滴加10 μl探針液,蓋上蓋玻片,放入原位雜交儀進(jìn)行變性雜交,設(shè)定變性條件為88℃、5分鐘,雜交條件為42℃、16小時(shí)。之后,用甲酰胺和SSC溶液浸洗,70%的乙醇脫水,避光室溫風(fēng)干。滴加10 μl的4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)復(fù)染劑,蓋上蓋玻片,避光放置10分鐘,進(jìn)行鏡下診斷。

1.5 免疫組化檢測(cè)

組織芯片的切片脫蠟脫水步驟同F(xiàn)ISH,然后放入EDTA溶液(pH8.0)中100℃20分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)。先后放入過(guò)氧化物酶阻斷劑溶液、正常非免疫動(dòng)物血清中室溫10分鐘,加雞尾酒抗體,室溫60分鐘。加二抗,室溫15分鐘,加堿性磷酸酶顯色劑,10-20分鐘,加辣根過(guò)氧化物酶顯色劑(AEC顯色劑)10-20分鐘,加蘇木素10-20秒,以上每一步驟結(jié)束均需PBS溶液沖洗3次,每次3分鐘然后進(jìn)行下一步驟。最后浸入PBS溶液后可自來(lái)水沖洗,烘干封片。

1.6 結(jié)果判讀

1.6.1ERG斷裂探針正常信號(hào)類型為兩融合(2F),即細(xì)胞核內(nèi)同時(shí)存在的兩對(duì)紅綠信號(hào)點(diǎn),當(dāng)出現(xiàn)TMPRSS2-ERG基因融合重排時(shí),信號(hào)類型為一紅一綠一融合(1R1G1F)、或者一紅一綠(1R1G)、或者多綠一融合(nG1f)。TMPRSS2-ETV1與TMPRSS2-ETV4融合探針的信號(hào)類型相同,正常信號(hào)類型為兩紅兩綠(2R2G),典型異常信號(hào)類型為一紅一綠兩融合(1R1G2F)。熒光顯微鏡下觀察至少50個(gè)腫瘤細(xì)胞,<10%判定為陰性,>50%判定為陽(yáng)性,在10%-50%之間則需另觀察50個(gè)腫瘤細(xì)胞,兩次結(jié)果相加計(jì)算百分率,<15%判定為陰性,≥15%判定為陽(yáng)性。

1.6.2雞尾酒抗體為紅色和棕褐色雙染,P504s呈紅色顆粒狀,定位于腫瘤細(xì)胞漿,P63和CK34βE12呈棕褐色,分別定位于基底細(xì)胞胞核和胞漿。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS20.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,IDC-P與其它組比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FISH方法檢測(cè)

2.1.1在IDC-P、浸潤(rùn)性篩狀癌、導(dǎo)管腺癌三組病例中檢測(cè)結(jié)果近似,出現(xiàn)TMPRSS2-ERG融合重排信號(hào)異常的陽(yáng)性標(biāo)本分別為有27例、25例、24例,TMPRSS2-ETV1陽(yáng)性病例分別為3例、2例、3例,TMPRSS2-ETV4陽(yáng)性病例分別為1例、1例、0例。TMPRSS2-ETS的相關(guān)基因在以上三組病例的總陽(yáng)性率分別為77.5%(31/40)、70%(28/40)、67.5%(27/40),差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2在HGPIN組病例中,出現(xiàn)TMPRSS2-ERG融合重排信號(hào)異常的陽(yáng)性標(biāo)本有2例,在未出現(xiàn)TMPRSS2-ERG融合重排的標(biāo)本中,TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4均為正常信號(hào)類型,未見融合重排信號(hào)異常,TMPRSS2-ETS相關(guān)基因的總陽(yáng)性率為5%(2/40)。在良性前列腺增生和正常前列腺組織中,表達(dá)與HGPIN組相近,僅出現(xiàn)1例正常前列腺組織TMPRSS2-ERG融合重排信號(hào)異常陽(yáng)性,其余均為正常信號(hào)類型。故IDC-P組較HGPIN組、良性前列腺增生和正常前列腺組織病例差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 免疫組化方法檢測(cè)

2.2.1檢測(cè)雞尾酒抗體,其中P504s抗體的陽(yáng)性率,在IDC-P為75%(30/40),在HGPIN為32.5%(13/40),在浸潤(rùn)性篩狀癌為100%(40/40),在導(dǎo)管腺癌為95%(38/40),表達(dá)呈弱陽(yáng)性至強(qiáng)陽(yáng)性。IDC-P組與以上另外三組相比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在良性前列腺增生和正常前列腺組織中,P504s均陰性,較IDC-P具有明顯差異性。

2.2.2雞尾酒抗體中的另外兩個(gè)抗體CK34βE12和P63,在IDC-P和HGPIN表達(dá)相似,大部分腺管基底膜可見連續(xù)陽(yáng)性或斷續(xù)陽(yáng)性,陽(yáng)性率均為90%(36/40),在良性前列腺增生和正常前列腺組織中陽(yáng)性率為100%(40/40),而它們?cè)诮?rùn)性篩狀癌和導(dǎo)管腺癌病例中大部分表達(dá)缺失,出現(xiàn)3例浸潤(rùn)性篩狀癌和1例導(dǎo)管腺癌病灶中間的少量散在弱表達(dá),視為表達(dá)陰性。故對(duì)于CK34βE12和P63這兩個(gè)抗體來(lái)說(shuō),IDC-P組與浸潤(rùn)性篩狀癌、導(dǎo)管腺癌組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IDC-P與HGPIN組、良性前列腺增生和正常前列腺組織差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

前列腺導(dǎo)管內(nèi)癌這個(gè)名詞最早是在1972年由Rhamy等[5]提出,經(jīng)過(guò)不斷地研究和總結(jié),發(fā)現(xiàn)無(wú)論在前列腺手術(shù)切除標(biāo)本還是穿刺活檢標(biāo)本,IDC-P都與幾種提示預(yù)后不良的臨床病理因素存在明確的相關(guān)性,包括Gleason評(píng)分高、腫瘤體積大、累及精囊腺、前列腺外侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等等[6]。WHO(2016)泌尿系統(tǒng)和男性生殖器官腫瘤分類中首次明確列出了IDC-P這一組織類型[2],定義為腺泡上皮和(或)導(dǎo)管上皮的腫瘤性增生,相比HGPIN具有更高的組織學(xué)和(或)細(xì)胞學(xué)的異形性,與高分期、高分級(jí)的前列腺癌的發(fā)生具有顯著相關(guān)性。IDC-P組織學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞局限在導(dǎo)管內(nèi)或腺泡內(nèi),可沿著導(dǎo)管和腺泡進(jìn)行浸潤(rùn)播散,并且基底細(xì)胞層保存或部分保存。很多學(xué)者實(shí)驗(yàn)了不同的方法,將IDC-P與HGPIN、浸潤(rùn)性篩狀癌、導(dǎo)管腺癌等組織學(xué)特征近似的前列腺腫瘤相鑒別[3,7],研究發(fā)現(xiàn),IDC-P與HGPIN具有極為近似的免疫組化表達(dá)特點(diǎn),包括雞尾酒抗體和PSA的表達(dá),常規(guī)的免疫染色對(duì)于鑒別兩者并沒有幫助,IDC-P與浸潤(rùn)性篩狀癌、導(dǎo)管腺癌這兩組病例可以分別通過(guò)雞尾酒抗體進(jìn)行鑒別。所以,IDC-P與HGPIN運(yùn)用常規(guī)方法難以鑒別,是目前病理診斷中的難點(diǎn)。

為了對(duì)IDC-P和HGPIN進(jìn)行鑒別,Lotan等[8]和Morais等[9]先后應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)二者腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中與張力蛋白同源的第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因(PTEN),結(jié)果均出現(xiàn)PTEN的缺失,分別為84%和76%,而HGPIN的表達(dá)正好相反,但該研究尚未通過(guò)大樣本量的前瞻性研究證實(shí)且敏感性不高,可以作為二者鑒別診斷中的輔助參考指標(biāo)。Han[10]等和Shah[11]等分析IDC-P和HGPIN具有明顯地組織學(xué)相似性,常規(guī)診斷標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法鑒別,在無(wú)浸潤(rùn)性癌的穿刺標(biāo)本中,基因檢測(cè)可幫助鑒別IDC-P和HGPIN,若出現(xiàn)TMPRSS2-ETS融合基因,則傾向IDC-P。該研究與本文研究方法相近,結(jié)論近似,均支持FISH檢測(cè)TMPRSS2-ETS融合基因在IDC-P和HGPIN鑒別中的重要作用,但該研究樣本量較少,且局限于無(wú)浸潤(rùn)性癌的情況,而實(shí)際工作中,IDC-P大部分都伴隨著Gleason評(píng)分高、腫瘤體積大的預(yù)后不良的浸潤(rùn)性癌[6],IDC-P是前列腺癌進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)因素,無(wú)論是否合并浸潤(rùn)性癌,均應(yīng)明確診斷IDC-P,故本文選擇病例并未區(qū)分是否伴有浸潤(rùn),本文研究結(jié)論與該研究相近,說(shuō)明無(wú)論是否伴有浸潤(rùn)性癌,不影響IDC-P和HGPIN的鑒別。

總而言之,IDC-P與HGPIN、浸潤(rùn)性篩狀癌、導(dǎo)管腺癌難以鑒別,是目前病理診斷中的難點(diǎn),運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)雞尾酒抗體可以初步將IDC-P、HGPIN這兩個(gè)腫瘤與浸潤(rùn)性篩狀癌、導(dǎo)管腺癌鑒別,運(yùn)用FISH檢測(cè)TMPRSS2-ETS融合基因可以進(jìn)一步鑒別IDC-P與HGPIN。