輔助生殖技術(shù)與印記基因疾病的研究進(jìn)展

艾初初 施曉鋆（通訊作者）

（貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州 貴陽(yáng) 550004）

自從1978年，世界第一例試管嬰兒Louise Brown的誕生以來(lái)，輔助生殖技術(shù)逐漸成為不孕不育夫婦助孕的重要方式。ART主要包括的操作有體外受精、胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）及植入前遺傳學(xué)診斷等[2]。盡管通過這種方式使得數(shù)千萬(wàn)的家庭孕育了自己的孩子，但由于ART涉及到誘導(dǎo)排卵、配子操作等非自然受孕過程，導(dǎo)致配子及胚胎的醫(yī)源性應(yīng)激，可能會(huì)對(duì)子代產(chǎn)生一定的影響，其安全問題越來(lái)越引起廣泛的重視。有研究顯示，輔助生殖技術(shù)在一定程度上導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育異常以及印記基因相關(guān)疾病的發(fā)生[3-5]。1993年以來(lái)，通過建立動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)胚胎培養(yǎng)會(huì)明顯影響胎兒發(fā)育以及印記基因的表達(dá)[6]。大量動(dòng)物模型試驗(yàn)和人類流行病學(xué)研究表明ART操作可能會(huì)在配子形成和早期胚胎發(fā)育時(shí)期影響印記基因調(diào)控[7]。對(duì)輔助生殖技術(shù)出生的兒童的隨訪研究表明，ART并沒有增加先天性畸形的發(fā)生率，然而，它增加了表觀遺傳疾病的發(fā)生率，如BWS、AS、SRS等。ART可能與在配子發(fā)生期間或受精后立即發(fā)生表觀遺傳重新編程的基因組印記異常風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[8]。

1.印記基因

生殖遺傳是指通過兩性生殖細(xì)胞內(nèi)染色體上的基因，將遺傳信息代代傳遞下去，使得子代具有親代的表型特征，遵循孟德爾遺傳定律[9]。而由沃丁頓于1942年首次提出的表觀遺傳學(xué)則主要研究的是在不改變DNA核苷酸序列的前提下基因表達(dá)發(fā)生改變的機(jī)制，具有不遵循孟德爾遺傳定律、獲得遺傳改變表觀遺傳的特點(diǎn)[10]?；蚪M印記是對(duì)基因組進(jìn)行表觀遺傳修飾的表觀遺傳過程，即在不改變DNA序列的情況下，沉默一個(gè)親本等位基因，只表達(dá)單等位基因[11]。其中，父系等位基因不表達(dá)者就稱為父系印記，而母系等位基因不表達(dá)者則稱為母系印記。目前發(fā)現(xiàn)的父系印記基因主要包括：H19、IGF2R、TSSC3、MASH2、GRAB10等，母系印記基因則主要包括：IGF2、PLAGL1、MEST、PEG等[12]。印記基因在胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育中有重要的作用，來(lái)自小鼠模型和罕見的人類印記障礙的證據(jù)表明，父系表達(dá)的基因有促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)的作用，而母系表達(dá)的基因則抑制胎兒生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子軸和IGF2/H19位點(diǎn)胰島素/IGF生長(zhǎng)因子軸包括胰島素（INS）、IGF1、IGF2及其相應(yīng)受體（IR、IGF1R、IGF2R）和6個(gè)結(jié)合蛋白（IGFBP16），是影響出生前后生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)的內(nèi)分泌因子。IGF2R位于人類染色體6q25.3，主要功能之一是溶酶體靶向和降解IGF2，從而起到抑制生長(zhǎng)的作用。IGF2和H19位于人類11p15染色體上，它們的相互印跡是由印跡控制區(qū)1（ICR1）的差異甲基化控制的，通常只在父系等位基因上甲基化。未甲基化的母體ICR1可與CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻斷IGF2啟動(dòng)子對(duì)H19下游增強(qiáng)子的通路，從而激活H19表達(dá)。相反，CTCF蛋白被阻止與父系甲基化的ICR1結(jié)合，導(dǎo)致IGF2啟動(dòng)子與增強(qiáng)子相互作用，導(dǎo)致單等位基因的父系IGF2表達(dá)。大約50%的生長(zhǎng)受限SRS病例在ICR1處甲基化缺失，這可能導(dǎo)致SRS的生長(zhǎng)受限[13]。在哺乳動(dòng)物的發(fā)育過程中，基因組信息有兩次大規(guī)模的重新編碼階段，主要是表觀遺傳修飾的改變。第一個(gè)時(shí)期主要在原始生殖細(xì)胞的發(fā)育過程中，DNA去甲基化消除表觀遺傳修飾，然后在配子的成熟過程中再重新甲基化，加上印記標(biāo)識(shí)；第二個(gè)時(shí)期則主要發(fā)生在早期胚胎植入階段，雖然這個(gè)時(shí)期DNA進(jìn)行大規(guī)模的去甲基化改變，但是印記基因甲基化水平并不改變[7]。甲基化水平變化最強(qiáng)烈的階段在配子形成和早期胚胎發(fā)育時(shí)期。如果在此期間發(fā)生不完全去甲基化或者過早發(fā)生再甲基化，可能會(huì)導(dǎo)致胚胎的死亡或者在子代出生后發(fā)生各種遺傳病[14]。ART操作可能會(huì)在配子形成和早期胚胎發(fā)育時(shí)期影響印記基因調(diào)控，印記基因igf2/H19異常甲基化可能會(huì)引起一些生長(zhǎng)障礙，例如BWS、RSS、宮內(nèi)和產(chǎn)后生長(zhǎng)遲緩綜合征等，通過ART技術(shù)出生的孩子患BWS綜合征的比例相對(duì)較高[15]。Soejima等也提出BWS與印記基因igf2/H19有關(guān)[16]。對(duì)配子及早期胚胎的研究結(jié)果顯示：ART操作不僅會(huì)引起低甲基化，而且會(huì)引起高甲基化，不僅會(huì)引起父源等位印記的異常而且會(huì)引起母源等位印記的異常[17]。ART目前還不能在精卵受精之前鑒別精子和卵細(xì)胞中染色體的表達(dá)是否完全正常，也不能確定原來(lái)正常的精子與卵細(xì)胞在受精時(shí)是否會(huì)出現(xiàn)異常。精子和卵細(xì)胞結(jié)合受精的過程是表觀遺傳修飾重置的關(guān)鍵階段之一，若在受精過程發(fā)生變異也可能會(huì)傳給子代[7]。有研究顯示，男性不育患者中精子的基因甲基化發(fā)生了改變，并且可能傳遞給子代[18]。而ICSI技術(shù)可能會(huì)增加印記疾病發(fā)生率，不成熟的精子可能尚未建立適當(dāng)?shù)挠∮浕蚣谆蚨蛔⑷胧芫笥绊懪咛グl(fā)育[19]。有報(bào)道一位男性不育患者經(jīng)ICSI技術(shù)出生的女嬰患RSS，其甲基化研究顯示父源性igf2/H19印記基因區(qū)域呈低甲基化中狀態(tài)。進(jìn)一步證明，ART可能與父源性等位基因突變有關(guān)[20]。

2.輔助生殖技術(shù)與印記基因疾病

2.1 ART與BWS

BWS綜合征，又稱臍膨出-巨舌-巨體綜合征，是一種先天性過度生長(zhǎng)綜合征，主要臨床變現(xiàn)為巨大兒、巨舌、新生兒低血糖、中線腹壁缺損等[21]。據(jù)估計(jì)BWS的發(fā)病率至少為1∶13700[22]。BWS由11p15.5區(qū)域母源或父源性印跡基因表達(dá)缺陷所致，與BWS相關(guān)的染色體印記區(qū)域包括：IGF2/H19、CDKN1C/KCNQ1OT1。KvDMR1去甲基化異常會(huì)引起KCNQ1QT過度表達(dá)，從而導(dǎo)致KCNQ1和受其調(diào)節(jié)的CDKN1C基因表達(dá)下降，而CDKN1C是一種生長(zhǎng)抑制基因，表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致臨床出現(xiàn)過度生長(zhǎng)；而H19DMR甲基化會(huì)引起B(yǎng)WS疾病[23]。有報(bào)道體外人工輔助生育技術(shù)授精兒童BWS的發(fā)生率較正常授精兒童為高[24-25]。目前發(fā)現(xiàn)ART可能會(huì)增加BWS發(fā)生率，采用ART懷孕的母親產(chǎn)出BWS患兒的機(jī)率是4.6%，而正常懷孕產(chǎn)出BWS患兒的機(jī)率是0.8%[26-27]。在7例ART出生的BWS患者中，5例是通過ICSI出生的，而檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有四例發(fā)生LIT1基因改變，1例發(fā)生H19、LIT1的印記基因異常[28]。

2.2 ART與SRS

SRS綜合征，又稱不對(duì)稱身材-矮小-性發(fā)育異常綜合征。主要臨床表現(xiàn)為胎兒嚴(yán)重宮內(nèi)及出生后生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、喂養(yǎng)困難、特殊面容、不對(duì)稱身材等[29]。關(guān)于SRS的病因，目前較明確的兩個(gè)分子機(jī)制是7號(hào)染色體母源單親二倍體（mUDP7）及11p15 ICR1低甲基化。可能為7號(hào)染色體上的母體生長(zhǎng)抑制因子過度表達(dá)以及父源促生長(zhǎng)基因低表達(dá)或失表達(dá)所致[30]。有研究發(fā)現(xiàn)SRS的生長(zhǎng)受限表型可能涉及igf2等促生長(zhǎng)因子的缺失[31]。在普通人群中SRS的發(fā)病率為1/50000-1/100000[32]，而法國(guó)一項(xiàng)研究了15162例通過ART出生的子代中，出現(xiàn)了6例SRS患兒，發(fā)病率較自然妊娠者高[33]。說明ART操作可能會(huì)影響該疾病的發(fā)病率。

2.3 ART與AS

AS綜合征，又稱快樂木偶綜合征，是一種較為罕見的嚴(yán)重神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病。主要臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力低下、孤獨(dú)內(nèi)向、吞咽困難、語(yǔ)言和運(yùn)動(dòng)功能障礙、癲癇等癥狀[34]。AS的自然發(fā)病率為1/50000～1/24000[35]。AS的發(fā)病與染色體15q11-q13區(qū)段中SNURF/SNRPN簇中UBE3A基因的異常有關(guān)。通常正常人腦組織中的母源性UBE3A基因表達(dá)，而父源性的相對(duì)沉默[36]。人類15號(hào)染色體的母系甲基化印記建立在受精時(shí)或之后，在此期間發(fā)生印記基因的缺失較多見[37]。而ART技術(shù)的操作較多在此時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致異常的印記建立。一項(xiàng)來(lái)自英國(guó)的研究發(fā)現(xiàn)，75例AS患者中有3例是通過ART出生的，并且這3例AS患者均存在SNRPN印記基因異常，推測(cè)與ART相關(guān)的AS是由于印記基因的異常甲基化引起的[38]。

輔助生殖技術(shù)在為人類克服生殖障礙的價(jià)值顯而易見，但是在ART的操作中涉及體外受精、ICSI、胚胎體外培養(yǎng)、超促排卵等關(guān)鍵技術(shù)，任何一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能會(huì)干擾印記基因的表達(dá)，從而可能會(huì)導(dǎo)致印記基因相關(guān)疾病。目前ART與印記基因失調(diào)所致的疾病的發(fā)生機(jī)制尚未明確。也有研究提出印記錯(cuò)誤早就存在于精子或卵細(xì)胞中，沒有證據(jù)表明IVF/ICSI與印記疾病有必然的因果關(guān)系[39]。正是由于ART的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，ART對(duì)子代的安全性問題將更加值得探究，以便造福人類。