miRNA-210對人乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移及侵襲的影響

黃琦 王芳 田進海 于晶晶 王嘉 王立斌（通訊作者）

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 寧夏 銀川 750004）

（2寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站 寧夏 銀川 750001）

miRNA是機體內(nèi)的一種短鏈RNA，該物質(zhì)在經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后可以對相關(guān)細(xì)胞的周期、凋亡、侵襲、血管生成以及遷移等過程進行水平調(diào)節(jié)，從而對其細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過程產(chǎn)生影響。本文分析miRNA-210對人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取來院就診與治療的患有乳腺癌疾病的患者20例，研究對象選取時間為2016年8月－2018年8月。本次研究通過道德倫理委員會的批準(zhǔn)，且經(jīng)過患者的同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 Real-timePCR法 首先提取總RNA（乳腺癌組織），并且將提取后的RNA進行反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)為cDNA［1］。miR-210細(xì)胞的上游引物序列為CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA，通用引物 Uni-miR realtime PCR引物為miR-210細(xì)胞的下游引物。隨后模版選取cDNA，內(nèi)參選取U6B，同時進行擴增，擴增后需要設(shè)置3個復(fù)孔［2］。

1.2.2 miR-210inhibitor轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中 將miR-210 inhibitor、miRNA inhibitor NC粉末（具有FAM 熒光標(biāo)記）進行離心處理，在離心處理完畢后將其配置成溶液，濃度為20μmol/L。在進行轉(zhuǎn)染前的1d鋪設(shè)24孔板，以此來提高溶液的融合度，一般融合度需要提高至30～50%。上述操作完畢后，將無抗生素（500μL）的培養(yǎng)基加入培養(yǎng)板中，隨后可以混合miRNA和 Lipofectamine 2000，20min室溫孵育。在MB-231細(xì)胞中加入混合物進行搖勻，在37℃下進行孵育［3］。

1.2.3 Transwell法 遷移：在轉(zhuǎn)染后的48h進行試驗，加入1300μL完全培養(yǎng)基加入24孔板中，隨后將其放置于培養(yǎng)箱中進行過夜放置，對細(xì)胞密度進行調(diào)節(jié)，同時加入200μl含0.2%BSA 的無血清細(xì)胞懸液，將1300μL完全培養(yǎng)基加入下層孔板中，隨后將其置于37℃中進行培養(yǎng)，隨后進行封片處理，并且進行計數(shù)。

侵襲：在轉(zhuǎn)染后的48h進行試驗，按照1：8稀釋基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基1d后鋪于小室上，隨后對細(xì)胞密度進行調(diào)節(jié)，同時加入200μl含0.2% BSA 的無血清細(xì)胞懸液至每孔中，將1300μL完全培養(yǎng)基加入下層孔板中，隨后進行封片處理，并且進行計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采取統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0進行數(shù)據(jù)處理，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 miR-210表達水平

miR-210在乳腺癌組織中的表達水平為（9.53±4.82），癌旁組織為（1.0±0.18），MDA-MB-231細(xì)胞為（6.04±1.74），正常乳腺細(xì)胞為（1.0±0.15），故乳腺癌組織、MDA-MB-231細(xì)胞與癌旁組織、正常乳腺細(xì)胞等組織中的miR-210表達水平差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 miR-210inhibitor轉(zhuǎn)染效率

miR-210inhibitor轉(zhuǎn)染效率為（88.28±2.99）%，結(jié)果說明miR-210 inhibitor已成功轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231 細(xì)胞。故經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，其細(xì)胞的增值能力較轉(zhuǎn)染前顯著下降。

2.3 抑制細(xì)胞增殖情況

轉(zhuǎn)染miR-210inhibitor細(xì)胞的克隆集落數(shù)為（17.39±2.98）個，而轉(zhuǎn)染miR-INC 組細(xì)胞的克隆集落數(shù)為（31.76±3.93）個，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。遷移試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-210inhibitor細(xì)胞的遷出細(xì)胞數(shù)量為（291.00±43.13）個，而轉(zhuǎn)染miR-INC 組細(xì)胞的遷出細(xì)胞數(shù)量為（1137.39±89.48）個，侵襲試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-210inhibitor細(xì)胞降解基質(zhì)膠且遷出細(xì)胞數(shù)量為（131.63±32.02）個，而轉(zhuǎn)染miR-INC 組細(xì)胞降解基質(zhì)膠且遷出細(xì)胞數(shù)量為（647.89±31.22）個，故經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，其細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到明顯抑制。

3.討論

根據(jù)大量數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌疾病已經(jīng)成為危害婦女身心健康的主要惡性腫瘤之一，且該類疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。隨著我國醫(yī)療技術(shù)的進步，對于該類疾病的治療出現(xiàn)了一種新形式，即分子靶治療。而分子靶治療需要一個有效的靶點，而miRNA便成為了診斷與治療的有效靶點。根據(jù)大量研究數(shù)據(jù)顯示，位于腫瘤相關(guān)基因組的區(qū)域和雜合型丟失區(qū)、脆性位點、擴增區(qū)或斷裂點區(qū)的miRNA超過一半，這些miRNA均可以作為抑癌基因或者致癌基因進而發(fā)揮作用，引發(fā)患者癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲等進程。目前，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達是miRNA的已知功能，可以作為負(fù)調(diào)控因子來參與基因的表達過程。同時有部分研究數(shù)據(jù)顯示，miRNA的作用靶點可以作為抑癌基因處于患者機體內(nèi)的擴增區(qū)來下調(diào)miRNA的表達，進而發(fā)揮抑癌基因樣作用。同時其靶點還可以作為癌基因，當(dāng)此基因表達水平顯著升高時，可以對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生抑制的作用。而在人乳腺癌細(xì)胞中，很多miRNA會出現(xiàn)異常表達的情況，在細(xì)胞的不同階段表達出不同的作用。miR-21會在乳腺癌患者機體內(nèi)的癌細(xì)胞中表達上調(diào)，其可能的靶基因為抑癌基因TPM1、PDCD4等。而miR-10b可以會對機體內(nèi)的HOXSD10產(chǎn)生抑制的作用從而達到促進轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞的作用，除此之外，在乳腺癌中miR-206還會與其表達水平以及ER的表達呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系。同時有部分研究顯示，組織的miRNA表達譜與乳腺癌患者的外周血循環(huán)miRNA表達譜有著較為密切的關(guān)聯(lián)，同時還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后，腫瘤臨床分期有著密切的關(guān)系。故在臨床診斷乳腺癌疾病中可以添加miR-210等指標(biāo)來進行診斷，提升疾病的診斷率。

miRNA在臨床上不僅具有較高的診斷價值，還可以作為一種新型的靶向治療手段，機體內(nèi)的miRNA可以對乳腺癌患者的原癌基因以及抑癌基因的表達進行有效調(diào)控，而根據(jù)大量文獻顯示，采取miRNA來作為治療靶點可以起到更佳有效的效果，特別是針對于單一的癌基因或者抑癌基因，目前在臨床試驗階段已經(jīng)加入了與miRNA功能相類似的小干擾RNA的相關(guān)藥物，現(xiàn)階段，已經(jīng)有部分報道顯示，在機體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miRNA的阻斷劑可以將腫瘤轉(zhuǎn)移的靶基因表達有效促進，并且可以對轉(zhuǎn)移灶的形成有效防止。

綜上所述，miRNA-210對人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響較大，可以明顯減弱其能力，本文研究結(jié)果也證實了miRNA-210的作用。