齊墩果酸新對肝癌的抑制作用研究進(jìn)展

蘇 雨，王海珠,楊 彬,萬明霞,劉馨澤,張璟祎,王浩天

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春130021)

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國大約3億人患有肝臟疾病，每年約有38.3萬人死于肝癌,占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%,嚴(yán)峻的形勢給我國的社會和醫(yī)療帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。齊墩果酸(oleanolicacid，OA)是以游離形式廣泛存在于草本植物中，如女貞子，西洋參，連翹，三七，人參等的五環(huán)三萜類化合物。該藥在20世紀(jì)70年代就開始用于治療肝炎。近年來，更有研究表明，OA能夠抑制惡性腫瘤如肝癌[1]、肺癌[2]等的生長有良好的作用，但其分子生物學(xué)作用機制尚不明確，現(xiàn)從細(xì)胞分子的層面上將肝癌的發(fā)病機制及特性，齊墩果酸的特性及其抑制肝癌機制綜述如下。

1 肝癌的發(fā)病機制

迄今為止，肝癌的致病原因尚待研究。目前認(rèn)為肝癌的發(fā)生是由病毒性特異因子、免疫機制、環(huán)境因素和個體遺傳背景相關(guān)基因共同作用的結(jié)果。

在我國，HBV、HCV或二者雙重感染會顯著增加患肝癌的幾率。其中乙型病毒蛋白HBx可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)，從而在病毒誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌中起重要作用[3]。另有基因測序技術(shù)表明肝癌細(xì)胞中，HBV DNA整合位點與易感基因/單核苷酸多態(tài)性也對肝癌由重要作用[4]。在西方，HCV誘導(dǎo)慢性炎癥進(jìn)而促進(jìn)肝癌發(fā)展，這一過程中包含了持續(xù)性慢性肝炎及纖維化、不可逆的遺傳改變以及惡性克隆[5]。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖、糖尿病及其代謝綜合征會引起非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，NAFLD可能在炎癥因子、氧化應(yīng)激、信號通路的激活及抑癌因素的減少的情況下發(fā)展成肝癌，但具體機制尚未明確，可能通過誘導(dǎo)肝臟的胰島素抵抗及多種促炎性細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6)、血管活性因子及促氧化分子的釋放來導(dǎo)致肝癌的發(fā)生和發(fā)展，也需進(jìn)一步的研究加以證實[6]。肝癌的發(fā)展與Hh的同源基因Shh信號通路激活后，增加細(xì)胞因子B1與周期依賴性蛋白激酶CDK1蛋白表達(dá)，進(jìn)而明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[7]。異常激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK使其磷酸化，激活靶分子c-Fos等[8]或異常激活c-Jun N末端蛋白激酶JNK信號通路引起下游通路蛋白P53等表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌增殖及血管生成，參加調(diào)控肝癌細(xì)胞的周期與凋亡進(jìn)程[9]。還有Notch信號通路作為多信號通路的交點，與TGF-β和NF-κB間接作用，在腫瘤細(xì)胞的增殖、成長、凋亡、遷徙、侵襲及血管生成中也其重要作用[10]。

2 肝癌的異質(zhì)性和特性

腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤廣泛存在的特性之一，其中肝癌異質(zhì)性最為明顯。諸多研究表明腫瘤異質(zhì)性這一重要特征在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[11]。

現(xiàn)在普遍認(rèn)為腫瘤異質(zhì)性的發(fā)生機理主要有克隆進(jìn)化模型和腫瘤干細(xì)胞模型兩種。第一種為在正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變這一階段，基因多次突變，造成基因型多樣性與表型上的改變，從而導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性。第二種則認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞分化產(chǎn)生不同克隆的腫瘤細(xì)胞亞群，二者相互形成動態(tài)作用造成腫瘤異質(zhì)性。

目前多認(rèn)為肝細(xì)胞癌多中心發(fā)生或原發(fā)癌的轉(zhuǎn)移可以顯示出顯著的肝癌異質(zhì)性。通過累積不同基因的改變而形成肝癌的多發(fā)生中心，Miao等多研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的相似的突變型基因[12]，有相似的基因譜，展現(xiàn)了肝癌的異質(zhì)性[13]。上面我們提到腫瘤干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)具備干細(xì)胞表型的肝癌亞型預(yù)后差,難以用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行界定。Tang[14]、Yamashita[15]等實驗發(fā)現(xiàn)不同類型表達(dá)的肝癌細(xì)胞具有不同的生物學(xué)行為，例如能促進(jìn)血管生成和腫瘤起始能力；或具有細(xì)胞內(nèi)皮特性易于細(xì)胞轉(zhuǎn)移；或賦予細(xì)胞耐藥特性，這些也影響了肝癌的異質(zhì)性。

3 齊墩果酸的生物學(xué)特性

齊墩果酸是一種天然五環(huán)三萜酸類化合物，廣泛存在與蔬菜、水果、草藥當(dāng)中，是最為常用的天然生物活性成分。在幾十年前被我國批準(zhǔn)用來作為保肝藥以及腫瘤病人的免疫調(diào)節(jié)劑。大量研究表明齊墩果酸有廣泛的生物活性及藥理作用，包括抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病、保肝、抗骨質(zhì)疏松等，其中最為有發(fā)展空間的實數(shù)它的抗腫瘤功效[16]。

齊墩果酸作為重要的植物提取物，已有實驗探討了以肝癌[17]、白血病[18]、肺癌[19]為研究對象的試驗中驗證了其具有克制腫瘤生長的效應(yīng)。通過抑制腫瘤生長三個階段的相關(guān)通路及基因，主要體現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖[20]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21]、抑制腫瘤新生血管形成[22]、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲[23]以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化[24]的作用。

4 齊墩果酸對肝癌的抑制作用

4.1 抗侵襲和抗轉(zhuǎn)移作用

腫瘤侵襲是腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，穿透基底膜，向周圍組織浸入生長的過程。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞通過毛細(xì)血管和淋巴管移動，離開腫瘤原發(fā)灶或繼發(fā)灶，形成新的腫瘤的過程，腫瘤的轉(zhuǎn)移也可以看成腫瘤侵襲的進(jìn)一步發(fā)展。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜、受多個影響因素控制的過程，任何參與調(diào)控的基因和涉及到的步驟發(fā)生改變，都有可能對侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。

在Chun-Che Lin 的報道[25]中指出OA 可以影響肝癌細(xì)胞株Hep3B、Huh7 和 HA22T的浸潤和遷移。還有研究表明，齊墩果酸對PGCL3細(xì)胞穿膜侵襲能力有顯著抑制作用，PGCL3細(xì)胞的穿膜運動能力和粘附能力，也均有顯著下降，其中OA是通過對黏附、運動、降解等多個侵襲作用的機理產(chǎn)生抑制，而不是在某一單一路徑產(chǎn)生抑制[26]。另一實驗進(jìn)一步證實了QA對PCCL3細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用，并認(rèn)為其抗轉(zhuǎn)移和侵襲機制是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表型分化，從而使參與侵襲轉(zhuǎn)移的蛋白酶產(chǎn)生減少，控制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時抑制了新生血管的產(chǎn)生[27]。腫瘤能夠誘導(dǎo)新生血管的形成而具有豐富的血管，其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移都依賴血管作為體內(nèi)的主要渠道來供給氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，因而腫瘤的侵襲和遷移依賴腫瘤血管的生成，因此，抑制腫瘤的侵襲和遷移的核心為抑制腫瘤血管的生成。

4.2 抑制新生血管

目前研究表明腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程都依賴血管作為體內(nèi)的主要渠道來供給氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，而血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是調(diào)節(jié)血管形成的主要細(xì)胞因子。VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白，部分能作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性。在正常生理條件下，VEGF作用于其特異性受體后，引起多個信號反應(yīng)，促進(jìn)血管增生。在低氧環(huán)境下，腫瘤分泌大量的VEGF，VEGF通過提高血漿酶原活化因子(PA)和血漿酶原活化因子抑制因子-l(PAI-1)的mRNA表達(dá)，來提高血漿酶原活化因子的活性，促進(jìn)細(xì)胞外蛋白水解，進(jìn)而促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成。腫瘤內(nèi)高濃度的VEGF能夠使血管的通透性增加，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[28]。有研究表明OA通過抑制VEGF在肝癌中的表達(dá)，降低VEGF的水平，從而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。

4.3 調(diào)節(jié)信號通路，對細(xì)胞凋亡的影響

4.3.1Bax基因通路機制 Bax為促凋亡基因，歸類為Bcl-2基因家族，能構(gòu)成同源二聚體加速凋亡或異源二聚體克制細(xì)胞凋亡，通過二者的比例變化來影響細(xì)胞的凋亡[29]。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號后，bax表達(dá)增加，作用表現(xiàn)在兩個方面：①與bcl-2形成同源二聚體加速凋亡；②同bcl-2結(jié)合成異源二聚體，降低bcl-2在細(xì)胞中的濃度，拮抗bcl-2的抑制凋亡作用。Bax基因表達(dá)的蛋白位于caspase3蛋白激活的上游，他將凋亡信號傳遞給下游的Caspase3，促使Caspase家族信號放大，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。Bax 是細(xì)胞線粒體凋亡通路的重要組成成員，與Bcl-2協(xié)同引起線粒體膜通透性改變，使跨膜電位消失，并釋放Cytochrome C，Cytochrome C和凋亡蛋白酶活化因子構(gòu)成多聚復(fù)合體Apaf-1，又透過Apaf-1氨基端的Caspase聚集結(jié)構(gòu)域使胞質(zhì)中的Caspase-9 前體聚集，激活Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，激活下游Caspase-3 和 Caspase-7，完成其相應(yīng)底物的剪切，引起細(xì)胞凋亡[31]。

4.3.2影響caspase 3表達(dá) 腫瘤的發(fā)生不僅是細(xì)胞增殖的異常，細(xì)胞凋亡通路也發(fā)生了改變，其中凋亡相關(guān)基因發(fā)揮了重要作用[32]。Caspase家族全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶[33]。

Caspase 3是Caspase家族中參與細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，分布于各種類型的細(xì)胞中[34]。Caspase 3主要是通過Fas/TNFR1介導(dǎo)的死亡受體途徑和線粒體途徑兩條通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35]。Caspase 3底物主要是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，也可參與U1-70K、DNA-PK、PKCd 和PKCq等底物的切割 。Caspase 3活化后直接參與切割細(xì)胞中相應(yīng)底物的多種蛋白,最終導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡[36]。

4.3.3抑制bcl-2通路機制 B淋巴細(xì)胞瘤-2基因簡稱bcl-2，Bcl-2基因是一種癌基因，它具有抑制凋亡的作用，BCL-2是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)BCL-2蛋白家族的成員之一[37]。它與許多的癌癥類型，以及一些精神疾病和自身免疫性疾病有關(guān)。在癌癥中，BCL-2可阻止一些細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞)凋亡。

通路機制：①細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個誘因證實可能為活性氧損傷造成但bcl-2的過表達(dá)可減少紙質(zhì)過氧化物和氧自由基的形成[38]；②推測bcl2可能參與抑制鈣離子跨膜運輸；③bcl2蛋白在凋亡發(fā)生過程中表現(xiàn)為離子通道蛋白和錨定蛋白存在[39]。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，OA對肝癌模型動物腫瘤組織中Bax、bcl-2、caspase 3的表達(dá)具有一定的影響，對腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用，并呈劑量依賴，已有研究也已證實了OA可上調(diào)多種腫瘤組織中以上基因的表達(dá)有一定的影響。

4.4 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

細(xì)胞周期(cell cycle)是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段，與腫瘤細(xì)胞的增長有密切關(guān)系。有研究表明齊墩果酸可以使肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞周期在G2/M期產(chǎn)生阻滯[40]。此外，還有一項關(guān)于骨肉瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，OA可以使大量骨肉瘤細(xì)胞阻滯于G1期，這一過程是通過抑制G1到S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵靶點cyclin D1而實現(xiàn)的[41]。細(xì)胞周期是受到多個調(diào)控因子和多個檢測點嚴(yán)密調(diào)控的，是一個有序而精確的過程，當(dāng)這些調(diào)控因子和檢測點功能發(fā)生紊亂時，就會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[42]。

4.5 OA對線粒體損傷及細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的調(diào)節(jié)作用

線粒體是目前公認(rèn)的最普遍的凋亡機制，一旦凋亡信號形成就會激發(fā)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Bal-2等促凋亡蛋白的形成，這些凋亡因子會轉(zhuǎn)移到線粒體進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體膜間質(zhì)凋亡蛋白、細(xì)胞色素C的釋放。Ca2+水平是機體維持功能的重要因素。在正常生理狀態(tài)下,Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的水平高，一旦機體出現(xiàn)異常，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平激增并進(jìn)入線粒體內(nèi)部，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放或活化caspase-12前體，從而激活caspase-9，啟動凋亡程序。

5 結(jié)論

隨著國內(nèi)近幾年肝癌的患病率的不斷增長，如何有效的抑制肝癌的發(fā)展，一直都是抗腫瘤藥物研發(fā)的重點和熱點。本文通過對齊墩果酸抑制腫瘤生長的多種作用機制的綜述回顧及展望，系統(tǒng)的闡述了齊墩果酸的藥理作用、對包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑制作用，對齊墩果酸作為抗腫瘤研發(fā)具有一定參考價值。