AQP4、KCNJ10基因與癲癇的關(guān)聯(lián)性研究進(jìn)展

張小冬， 張?zhí)禧悾?史 靜綜述， 李偉榮審校

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)第二大類疾病，其發(fā)作是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)“興奮”和“抑制”兩者之間的不平衡而引起的神經(jīng)元的異?；顒印Ｑ芯空邆冎饾u發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的興奮與抑制的失衡，主要與離子通道功能障礙以及神經(jīng)遞質(zhì)的改變有關(guān)。近年來人們對其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識已由器官、組織水平逐漸深入到細(xì)胞和分子水平。除神經(jīng)元之外，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞也參與了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。眾所周知腦內(nèi)細(xì)胞膜上的離子通道是調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與癲癇灶起源和擴(kuò)散關(guān)系尤為密切。編碼離子通道蛋白的基因一旦發(fā)生突變，即可能出現(xiàn)電解質(zhì)轉(zhuǎn)運和分布的異常，通過影響其膜電位進(jìn)而引起神經(jīng)組織興奮性異常改變，導(dǎo)致癲癇的發(fā)生。其中離子通道與癲癇的相關(guān)性較為明確(如鈉、鉀、鈣等)[1]。近年來國內(nèi)外研究表明，在生理狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞中水通道蛋白4(AQP4)及內(nèi)向整流鉀離子通道(Kir4.1)協(xié)同調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的水、電解質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。這兩種膜蛋白不僅結(jié)構(gòu)上相似，且在功能也存在一定的共耦聯(lián)關(guān)系。已有實驗發(fā)現(xiàn)兩者在癲癇的發(fā)病機(jī)制以及在癲癇治療中的耐藥性方面發(fā)揮著重要的作用。然而也有研究認(rèn)為鉀通道的異?？赡苁菣C(jī)體對癲癇發(fā)作的保護(hù)性反應(yīng)，并非癲癇灶點燃的原因。本文回顧了近年來星形膠質(zhì)細(xì)胞中水通道蛋白4及內(nèi)向整流鉀離子通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性及癲癇發(fā)病的文獻(xiàn)，總結(jié)AQP4基因、CNKJ10基因在癲癇發(fā)病機(jī)制中的潛在作用，為抗癲癇的治療提供新思路。

1 AQP4基因與癲癇

AQP4基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子構(gòu)成，位于染色體18q11.2與18q12.1之間的連接處。AQP4蛋白四級結(jié)構(gòu)是具有獨立活性的亞單位組成的同源四聚體表達(dá)于細(xì)胞膜上，其氨基端和羧基端位于胞內(nèi)，每個亞基含有6個疏水性的跨膜α右手螺旋結(jié)構(gòu)，以及各亞基間含有5個長度不一的連接環(huán)[包含AQP家族成員共同的特征性結(jié)構(gòu)天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸(NPA)重復(fù)串聯(lián)序列]，6個跨膜區(qū)域和5個連接環(huán)在中線處交叉重疊形成狹窄的開放水分子孔道，即被證實的“沙漏”模型，決定了AQP4對水的高通透性并調(diào)節(jié)水分子的轉(zhuǎn)運[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)13種亞型[3]，其中AQP4是腦內(nèi)含量最多且分布最廣的類型，主要分布于神經(jīng)組織的支持細(xì)胞，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)界膜、室管膜等部位，與水分子在腦細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運有關(guān)。其中毛細(xì)血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜是其最主要的表達(dá)區(qū)域[4]，而在靠近神經(jīng)氈的一側(cè)則分布較少，這種極性分布的特點有利于水分子在膠質(zhì)細(xì)胞、血液和腦脊液之間進(jìn)行轉(zhuǎn)運，對腦內(nèi)水分子代謝平衡調(diào)節(jié)及腦脊液產(chǎn)生方面起著重要作用。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)AQP4還參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞的諸多生理功能，包括：鈣信號傳導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)、突觸可塑性、神經(jīng)再生等。因此，AQP4被認(rèn)為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)癲癇、腦水腫、腦卒中[5]、多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎[6]、創(chuàng)傷后腦損傷、帕金森病等密切相關(guān)。

水分子和鉀離子滲透壓的改變可以顯著影響癲癇的易感性。首先，腦組織興奮性與細(xì)胞外間質(zhì)(ECS)的滲透壓和容積密切相關(guān)。ECS容積縮小可導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮并促進(jìn)癇性放電。相反，ECS容積增加可抑制癇性放電。另外，研究表明，海馬組織中ECS內(nèi)微量的鉀離子濃度的增加即易導(dǎo)致癇性放電。難治性癲癇患者中高鉀極易導(dǎo)致癲癇發(fā)作。目前關(guān)于AQP4在癲癇致病中的作用機(jī)制探討絕大多數(shù)仍來自于對AQP4基因敲除小鼠的研究。AQP4基因切除小鼠是在1997年通過AQP4靶向基因切除建立的。起初，研究者最早發(fā)現(xiàn)AQP4基因切除小鼠的聽力輕度損害，即腦干聽覺誘發(fā)電位的閾值增高，并未發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能異常。后來，更多關(guān)于AQP4基因切除小鼠腦組織生物學(xué)特性的研究顯示，AQP4基因敲除的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)水分子滲透性較普通小鼠下降了7倍。表明了AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞水分子轉(zhuǎn)運過程中起著重要作用。無論是國內(nèi)還是國外學(xué)者，均通過腹腔注射鋰-匹羅卡因的方法建立SD大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)模型，動態(tài)研究了AQP4在大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后的表達(dá)，一致發(fā)現(xiàn)AQP4在SE后腦水腫形成過程中起關(guān)鍵作用，其機(jī)制可能與AQP4表達(dá)上調(diào)，通過水分子的轉(zhuǎn)運改變了細(xì)胞內(nèi)外水分子的分布，從而細(xì)胞內(nèi)氯化物、谷氨酸鹽等陰離子發(fā)生了繼發(fā)性轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸鹽濃度增高，激活富含神經(jīng)元區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞活動從而誘導(dǎo)癲癇發(fā)作有關(guān)。然而，一些研究者得出了相反結(jié)果，認(rèn)為SE后腦水腫的主要原因是AQP4表達(dá)下降，Tang等人[7]對癲癇持續(xù)狀態(tài)的小鼠在發(fā)病3 h～3 d小腦AQP4表達(dá)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)AQP4表達(dá)水平下降，直至第7天才恢復(fù)正常水平。猜想研究結(jié)果的不一致可能與動物選擇、觀察時期不同等有關(guān)，需要我們進(jìn)一步實驗證實。

顳葉癲癇中約50%～70%的患者伴有海馬硬化，海馬硬化被認(rèn)為是顳葉癲癇的重要病理改變。研究發(fā)現(xiàn)，海馬硬化患者的顳葉在頭部MRI上表現(xiàn)為T2加權(quán)序列及彌散像上高信號的特點，提示海馬硬化組織有水分子增加的跡象。他們對手術(shù)治療過程中海馬硬化的腦組織標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海馬硬化區(qū)整體AQP4含量增高，可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞活躍增生有關(guān)。另外，美國耶魯大學(xué)Tih等學(xué)者對伴海馬硬化的顳葉癲癇患者的手術(shù)切除致癇灶的研究也同樣發(fā)現(xiàn)：在硬化海馬組織中，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生顯著，AQP4在U133A基因芯片及QRT-PCR技術(shù)中的表達(dá)均上調(diào)，提示AQP4可能與海馬硬化及癲癇發(fā)作有關(guān)[8]。

Samira等人對AQP4基因敲除小鼠體外培養(yǎng)過程的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，基因敲除小鼠在細(xì)胞學(xué)形態(tài)、增殖及粘附運動方面并無明顯差異，但Transwell遷移率及創(chuàng)面自愈能力明顯低于野生型小鼠；而對野生型小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 RNA進(jìn)行抑制后，它們的遷移率和自愈能力也表現(xiàn)出明顯下降，提示AQP4可能參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化遷移和膠質(zhì)瘢痕的形成過程[9]。而星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)瘢痕的形成則會造成異常的神經(jīng)環(huán)路形成，從而導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性增高誘發(fā)癲癇發(fā)作，這種異常的神經(jīng)環(huán)路對對抗癲癇藥物(AEDs)也具有阻擋作用，這可能是導(dǎo)致癲癇耐藥的原因之一。

目前市面上的抗癲癇藥物(AEDs)種類繁多，根據(jù)其不同的作用機(jī)制，分為：(1)增強(qiáng)GABA受體興奮性藥物：如丙戊酸鈉；(2)減少神經(jīng)遞質(zhì)釋放藥物，主要是拮抗興奮性氨基酸，降低興奮性遞質(zhì)的活性，如托吡酯；(3)膜穩(wěn)定劑，主要是作用于電壓門控的鈉通道，如卡馬西平。對臨床中常用的抗癲癇藥物作用機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，包括卡馬西平、托吡酯等多種抗癲癇藥物均具有部分AQP4阻斷的作用，提示AQP4的阻斷可能起到一定的抗癲癇作用，可能與阻斷AQP4的水分子轉(zhuǎn)運，從而抑制了細(xì)胞內(nèi)外離子的繼發(fā)性轉(zhuǎn)運有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究來證實癲癇發(fā)作中AQP4的深層作用機(jī)制。

2 KCNJ10基因與癲癇

內(nèi)向整流鉀離子通道(Kir4.1)是一種整合膜蛋白，亦主要由4個亞基構(gòu)成，每個亞基具有6個跨膜區(qū)段，共同構(gòu)成了K+孔道，對鉀離子的內(nèi)流具有高通透性。Kir4.1存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，可由內(nèi)源性ATP激活，主要功能是將膠質(zhì)細(xì)胞外的鉀離子轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞外間質(zhì)中過量的K+濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，維持其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Kir4.1編碼基因為位于1q22-q23上的KCNJ10基因，該基因存在于大多數(shù)哺乳動物的細(xì)胞內(nèi)。

早期研究表明，癲癇發(fā)作時神經(jīng)元異常放電與細(xì)胞內(nèi)外鉀離子異常分布有關(guān)，胞外K+濃度升高導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，從而增高了神經(jīng)元興奮性，誘發(fā)癲癇發(fā)作。當(dāng)用毛果蕓香堿誘發(fā)癲癇模型發(fā)作時，觀察細(xì)胞內(nèi)外鉀離子濃度變化，發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外鉀離子濃度的身高可促使神經(jīng)元興奮性增高，增加癲癇活動的發(fā)生，此時膠質(zhì)細(xì)胞中Kir4.1水平增高，導(dǎo)致鉀離子內(nèi)流，緩沖細(xì)胞外過多的鉀負(fù)荷，抑制了癲癇的發(fā)作[10]。KCNJ10基因作為Kir4.1的編碼基因，是小鼠和人癲癇的易患基因，國外Biljana等人對Kir4.1基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Kir4.1的缺失會引起星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞對興奮性遞質(zhì)谷氨酸的攝入減少，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮性增強(qiáng)，誘發(fā)癇性發(fā)作。此外，Kir4.1與膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育形成關(guān)系密切，敲除Kir4.1基因的小鼠可出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、癲癇、甚至早期死亡等表現(xiàn)[8]。在伴有海馬硬化及先前有過高熱驚厥的顳葉癲癇患者的DNA中發(fā)現(xiàn)Kir4.1編碼基因單核苷酸突變，表明KCNJ10在癲癇易感性中發(fā)揮著重要作用。有趣的是，一些研究者發(fā)現(xiàn)癲癇與自閉癥譜系病(ASDs)有著強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)性。在52例KCNJ10發(fā)生突變的隱源性癲癇的患者中發(fā)現(xiàn)，2/3的患者伴有2個雜合突變(p.Arg18Gln 和 p.Val84Met)，且與家族癲癇無關(guān)。這就表明腦內(nèi)異常的K+滲透壓可能會增加自閉癥-癲癇表型的易感性[11]。

中國一項對全面遺傳性癲癇(GGEs)患者KCNJ10基因突變與癲癇易感性和藥物抵抗關(guān)系的研究，分別對284例健康對照組及483例GGEs患者(包括279例抗癲癇藥物敏感，204例藥物抵抗的患者)KCNJ10基因的8個SNPs進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，rs6690889 TC+TT在GGEs組中低表達(dá)[6.7% vs 9.5%，P=0.01，OR=0.50(0.29～0.86)]。rs1053074 G等位基因在兒童失神性發(fā)作(CAE)中表達(dá)頻率較健康對照組低[28.4% vs 36.2%，P=0.01，OR=0.70(0.53～0.93)]。rs12729701 G等位基因及AG+GG表型在CAE組中也較健康對照組表達(dá)頻率低[21.2% vs 28.4%，P=0.01，OR=0.74(0.59～0.94) and 36.3% vs 48.1%，P=0.01，OR=0.83(0.72～0.96)]。rs12402969 C等位基因和CC+CT表型在GGEs藥物敏感性患者中的表達(dá)頻率高于藥物抵抗組[9.3% vs 5.6%,OR=1.73(1.06～2.85)，P=0.026 and 36.3% vs 48.1%，P=0.01，OR=0.83(0.72～0.96)]。該研究表明KCNJ10基因SNPs與癲癇的易感性及抗癲癇藥物抵抗有關(guān)[12]。另外，Lenzen PK等人發(fā)現(xiàn)KCNJ10等位基因的突變也與全面遺傳性癲癇發(fā)作有關(guān)。然而，是否KCNJ10基因編碼的Kir.4異常是癲癇發(fā)作的根本病因或是主要原因仍須進(jìn)一步研究。

目前大部分AEDs均作用于電壓門控鈉離子通道、鈣離子通道或參與GABA遞質(zhì)調(diào)節(jié)，而作用于Kir4.1等鉀離子通道的AEDs少見。綜上所述，鉀離子通道(包括內(nèi)向整流及電壓門控)對神經(jīng)元動作電位、興奮性以及突觸可塑性均有一定影響，因此有學(xué)者提出：新型抗癲癇藥物的研究可以鉀離子通道作為藥物靶點，為癲癇治療提供新思路。

3 AQP4基因及KCNJ10基因的關(guān)聯(lián)性

近年來的研究已證實，AQP4與Kir4.1在Maller細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞血管周圍終突上呈現(xiàn)極性分布，兩者不僅在空間上共表達(dá)，而且在功能上也相耦聯(lián)[13]。AQP4介導(dǎo)水分子跨膜轉(zhuǎn)運的同時，伴隨Kir4.1對細(xì)胞外鉀離子的緩沖作用，共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外間質(zhì)中水、K+重新分布，維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及對中樞神經(jīng)元興奮性有重要的調(diào)節(jié)作用。對海馬CA1區(qū)AQP4基因敲除小鼠研究顯示，AQP4消失后，K+清除時間延長，導(dǎo)致了神經(jīng)元興奮性增高，誘發(fā)癲癇發(fā)作。Binder等人[14]對AQP4基因敲除小鼠顳葉給予致癇刺激后，運用鉀敏感的微電極對K+變化進(jìn)行了測量，結(jié)果顯示K+變化曲線的基線及峰值較野生型小鼠基本一致，但由基線上升至峰值及由峰值下降到基線的時間明顯延長，出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因考慮為：AQP4的缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外水分子分布發(fā)生了相應(yīng)的改變，從而引起Kir4.1對鉀離子通透性的改變，使細(xì)胞膜電位發(fā)生相應(yīng)變化，破壞了細(xì)胞外鉀離子平衡狀態(tài)。然而，一些學(xué)者對AQP4與Kir4.1功能耦連理論提出質(zhì)疑， Ruiz-Ederra[15]及Zhang[16]等急性分離了AQP4基因敲除小鼠中的視網(wǎng)膜Maller細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Kir4.1的分布和功能特征沒有明顯改變，因此他們認(rèn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中Kir4.1與AQP4之間無相關(guān)性，由此看來二者之間的關(guān)聯(lián)性仍需我們進(jìn)一步研究證實。

4 癲癇與AQP4基因、CKNJ10基因的多態(tài)性

顳葉癲癇(temporal lobe-epilepsy，TLE)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，占成人局灶性癲癇發(fā)作的1/3。Kjell Heuser等對218例挪威TLE患者進(jìn)行了研究，其納入患者中，伴海馬硬化者56例，高熱驚厥者102例，結(jié)果表明，AQP4及KCNJ10/KCNJ9基因多態(tài)性可能與TLE，特別是伴海馬硬化者有關(guān)[17]國內(nèi)徐仟等人[18]通過光鏡及透射電鏡觀察組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)，免疫熒光組織化學(xué)法觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4和Kir4.1的分布特點發(fā)現(xiàn)，不伴有顳葉內(nèi)側(cè)癲癇的海馬組織中，在星形膠質(zhì)細(xì)胞血管周圍AQP4和Kir4.1呈現(xiàn)極性分布；而在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇的海馬組織中,AQP4和Kir4.1的極性分布特點發(fā)生改變，且其分布特點的改變可能與顳葉內(nèi)側(cè)癲癇發(fā)生相關(guān)。另一些研究表明：中樞星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4分布的改變，可以導(dǎo)致細(xì)胞水腫，存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的氯化物、谷氨酸鹽及其它陰離子物質(zhì)代償性的通過容積敏感性陰離子通道釋放至細(xì)胞外，最終導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸鹽濃度增高，激活神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)從而激發(fā)顳葉癲癇。然而，牛鳳鶴等[19]學(xué)者對中國漢族人群顳葉癲癇患者的研究發(fā)現(xiàn)KCNJ10和AQP4基因多態(tài)性在顳葉癲癇的發(fā)生和發(fā)展過程無重要作用。這二者研究結(jié)果的差異可能與不同人群之間存在異常異質(zhì)性，并且TLE受諸多易感基因和復(fù)雜環(huán)境影響有關(guān)。一方面，癲癇的類型眾多，很大一部分癲癇患者與上述兩種基因多態(tài)性的關(guān)系不明確;另一方面，研究納入人群的年齡無特殊限制，先天遺傳因素及后天環(huán)境因素與上述兩種基因多態(tài)性的相關(guān)性尚不明了，因此，KCNJ10及AQP4基因是否相互協(xié)同影響癲癇發(fā)生仍需要進(jìn)一步研究證實。

5 展 望

癲癇的形成過程復(fù)雜，是多因素共同發(fā)展所致。雖然多組證據(jù)已表明神經(jīng)元活動過程中，膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的AQP4蛋白以及內(nèi)向整流鉀離子通道對水和K+滲透壓的改變起重要的作用。K+濃度與癲癇易感性密切相關(guān)，但AQP4及KCNJ10基因多態(tài)性在癲癇發(fā)生和發(fā)展中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外，癲癇發(fā)作類型多，存在多種綜合征，個體間臨床差異大，不同年齡致病因素不同，因此，對于不同類型、不同年齡的癲癇患者AQP4及KCNJ10基因多態(tài)性的相關(guān)性仍亟待進(jìn)一步研究。