科學(xué)家實(shí)現(xiàn)小鼠個(gè)體水平的靶向遺傳篩選

近年來(lái)，CRISPR-Cas9技術(shù)介導(dǎo)的突變篩選在小鼠和人細(xì)胞中已被廣泛應(yīng)用，而實(shí)現(xiàn)高效的小鼠個(gè)體水平遺傳篩選對(duì)哺乳動(dòng)物功能基因組研究具有重要意義。

中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）李勁松和鄒衛(wèi)國(guó)研究團(tuán)隊(duì)合作應(yīng)用孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞（“人造精子細(xì)胞”）介導(dǎo)的半克隆技術(shù)，結(jié)合CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了小鼠骨發(fā)育相關(guān)基因的個(gè)體水平遺傳篩選，并揭示Irx5基因作為骨發(fā)育過(guò)程中重要調(diào)控因子，通過(guò)抑制PPARγ分子促進(jìn)成骨分化并抑制成脂分化，為小鼠發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵基因功能研究開辟了新的途徑。該研究成果在線發(fā)表于《美國(guó)科學(xué)公共圖書館·生物》（Plos Biology）。

李勁松研究員介紹，科研人員基于體外成骨分化過(guò)程高通量測(cè)序分析數(shù)據(jù)，篩選了72個(gè)潛在骨發(fā)育相關(guān)基因，建立了一個(gè)攜帶216個(gè)向?qū)NA（sgRNA）的單倍體干細(xì)胞庫(kù)（即“人造精子細(xì)胞庫(kù)”），其中的每個(gè)“人造精子”一般都攜帶一個(gè)針對(duì)不同基因的“sgRNA導(dǎo)航器”，精確定位到靶基因上并對(duì)其進(jìn)行基因編輯。李勁松解釋道，“我們將這些攜帶修飾基因的‘人造精子’逐一注射入小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞，一個(gè)月不到，就獲得了400多只攜帶不同突變基因的半克隆小鼠?！?/p>

鄒衛(wèi)國(guó)研究員說(shuō)：“我們?cè)谶@些小鼠出生后，就開始對(duì)其進(jìn)行骨骼整體染色分析，依據(jù)骨骼大小、鈣化、顱頂骨、長(zhǎng)骨、椎骨形態(tài)等指標(biāo)對(duì)每只小鼠進(jìn)行評(píng)分。與此同時(shí)，我們利用每只小鼠攜帶的‘sgRNA導(dǎo)航器’對(duì)骨發(fā)育異常的小鼠所攜帶的‘靶基因’的測(cè)序分析，最終確定其是否存在基因突變?！?/p>

“我們從72個(gè)候選基因中篩選出了4個(gè)參與骨發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因?！编u衛(wèi)國(guó)進(jìn)一步介紹說(shuō)，“在這4個(gè)關(guān)鍵基因中，基因Zic1和Clec11a被其他研究證實(shí)參與骨發(fā)育調(diào)控，而基因Rln1和Irx5在小鼠骨發(fā)育過(guò)程中的功能尚不明確。為了驗(yàn)證它們?cè)谛∈蠊趋腊l(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，我們構(gòu)建了基因Rln1和基因Irx5敲除的小鼠模型來(lái)驗(yàn)證這兩個(gè)基因在骨發(fā)育過(guò)程中的作用，發(fā)現(xiàn)敲除了Rln1基因的小鼠在出生時(shí)骨骼較小，而成年后差異不顯著；敲除基因Irx5的小鼠在出生時(shí)和成年后骨骼較小和骨量下降特征均很顯著，同時(shí)伴隨著骨髓中脂肪形成增加的特征。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明，IRX5通過(guò)抑制PPARγ通路的激活，促進(jìn)成骨分化同時(shí)抑制脂肪生成?！?/p>

“這項(xiàng)研究的理論價(jià)值在于首次實(shí)現(xiàn)了小鼠個(gè)體水平骨發(fā)育靶向遺傳篩選?！闭劶皩?duì)于未來(lái)的臨床應(yīng)用價(jià)值，鄒衛(wèi)國(guó)表示，“我們希望我們的基礎(chǔ)研究能為臨床服務(wù)，為骨質(zhì)疏松癥的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用等提供理論支撐?！?/p>