‘云香’水仙NtNAC2基因的克隆及功能分析

肖瑤宇，劉 洋，李全超，李 琳，陳曉靜

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福州 350002)

植物經(jīng)常遭受非生物脅迫，如高鹽和干旱等，這極大地限制了生長(zhǎng)發(fā)育，促使植物進(jìn)化出一系列生理和分子機(jī)制以適應(yīng)非生物脅迫[1-2]。為更好地應(yīng)對(duì)逆境脅迫，以轉(zhuǎn)錄因子作為研究目標(biāo)，通過分子育種方法來提高抗逆性成為研究熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道稱，大約7%的植物基因組編碼序列被分配到轉(zhuǎn)錄因子(TF)，其中NAC(NAM、ATAF、CUC)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的、數(shù)量最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[3]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在擬南芥中有117個(gè)、水稻中151個(gè)、大豆和煙草中各有152個(gè)[4-7]，這些NAC轉(zhuǎn)錄因子有相似的結(jié)構(gòu)，N端具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分成5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A～E)，C端存在可變的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[8]。

大量研究表明，一些過表達(dá)的NAC基因可直接或間接調(diào)節(jié)相關(guān)應(yīng)答基因的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性。如擬南芥ATAF1在干旱、高鹽、ABA、MeJA、機(jī)械損傷和灰霉病菌侵染誘導(dǎo)下表達(dá)，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系主根縮短，從而增強(qiáng)耐旱性[9]；水稻SNAC1分別轉(zhuǎn)入水稻、小麥、棉花植株中，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)外源ABA高度敏感，結(jié)實(shí)率增加，抗旱性和耐鹽性都有所提高[10-12]；小麥TaNAC29和鷹嘴豆CarNAC6轉(zhuǎn)入擬南芥，促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)，增加存活率，從而明顯提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性[13-14]；小麥TaRNAC1在根中高水平表達(dá)，過表達(dá)植株在PEG處理下，生物量和谷物增多，表現(xiàn)出更高的脫水耐受性[15]；玫瑰花瓣中RhNAC2、RhNAC3通過調(diào)控滲透相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)耐旱性[16-17]；香蕉MusaSNAC1通過提高干旱脅迫下保衛(wèi)細(xì)胞中的H2O2含量來誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，減少水分損失，從而提高過表達(dá)株系的耐旱性[18]；南瓜CmNAC1在根、莖、葉和下胚軸等不同組織部位都表達(dá)，能響應(yīng)高鹽、低溫、干旱、ABA 和H2O2脅迫，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高鹽、干旱、低溫脅迫的耐受性增加[19]；胡楊PeNAC036能被干旱、鹽誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥蒸騰速率降低，抗旱性增強(qiáng)[20]。上述可見，NAC轉(zhuǎn)錄因子已應(yīng)用于各種草本、木本植物，從而使植物對(duì)非生物脅迫的耐受性得到定向改良。中國(guó)水仙NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道相對(duì)較少，李夢(mèng)思等[21]克隆了‘云香’水仙NtNAC3153，表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)NtNAC3153在ABA、高鹽和高溫脅迫下能被誘導(dǎo)，可能參與抗逆調(diào)控，尚缺乏生物學(xué)功能驗(yàn)證。

中國(guó)水仙作為十大傳統(tǒng)名花之一，主要分布在福建漳州，冬季開花常作為年宵花卉，極具觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來漳州城市化發(fā)展，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)格局發(fā)生變化，打破糧食和花卉輪作機(jī)制，分配給水仙種植面積不斷減少，導(dǎo)致水仙花產(chǎn)量快速下滑, 出口額也呈下降趨勢(shì)，嚴(yán)重制約水仙花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。水仙多為三倍體，傳統(tǒng)雜交育種培育抗性新品種困難[22]。為解決這一困境，可采用分子育種發(fā)掘水仙抗逆相關(guān)NAC基因展開抗逆機(jī)理研究，提高抗逆性，使其能在干旱、灘涂、鹽堿等貧瘠的荒地中正常生長(zhǎng)，是水仙擴(kuò)大種植面積、提高產(chǎn)量、提升品質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?！葡恪墒沁x育的新品種，對(duì)干旱和高鹽具有很強(qiáng)的適應(yīng)性[22]。因此選擇‘云香’水仙為實(shí)驗(yàn)材料，通過RT-PCR克隆獲得一條新的NAC基因NtNAC2，以期通過生物信息學(xué)分析、組織及逆境脅迫下表達(dá)分析，探討NtNAC2基因的生物學(xué)功能，進(jìn)一步構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化煙草，在高鹽、干旱脅迫條件下對(duì)NtNAC2基因進(jìn)行功能初探，旨在篩選NAC候選基因，轉(zhuǎn)化中國(guó)水仙，以期為提高水仙抗逆性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及其處理

供試材料為水仙新品種‘云香’，2017年10月初選取大小一致的3年生種球于4 ℃冷藏1個(gè)月，消毒處理后水培10 d，待嫩葉長(zhǎng)至3～4 cm，濾紙吸干鱗莖球和根部表面水分后，進(jìn)行不同處理。外源激素處理：分別用0.1 mmol/L ABA、0.1 mmol/L MeJA和2 mmol/L SA溶液浸泡種球根部，同時(shí)以霧噴方式噴灑嫩葉。非生物脅迫處理：分別用10 mmol/L H2O2、20% PEG6000和250 mmol/L NaCl溶液浸泡種球根部，以及置于50 ℃的高溫光照培養(yǎng)箱。以未經(jīng)處理(0 h)為對(duì)照，處理期間在特定時(shí)間點(diǎn)(1、3、6、12、24和48 h)分別采集根和葉。2017年10月中旬，開始水培種球至開花，期間分別采集根、葉、鱗莖等組織部位，以及花器官整個(gè)發(fā)育時(shí)期的花瓣和副冠。每個(gè)處理設(shè)定3次重復(fù)，具體取樣方式參照溫秀萍等[23]的方法，低溫-80 ℃儲(chǔ)存。

儲(chǔ)存的樣品加入液氮研磨勻漿處理后，用EZNA Plant RNA Kit(OMEGA)試劑盒提取樣品總RNA，并通過1%瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性和純度。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組DNA污染，合成第一鏈cDNA。Free dH2O(TaKaRa)稀釋濃度至10 μmol/L，存于-20 ℃，用于后續(xù)PCR試驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1NtNAC2基因全長(zhǎng)cDNA克隆及載體構(gòu)建基于‘云香’水仙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中NAC序列，經(jīng)NCBI Blastp篩選可能與抗性相關(guān)的NAC序列，遵循引物設(shè)計(jì)原則，用Primer 6.0和Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)2條特異性引物NtNAC2-F和NtNAC2-R(表1)。以花瓣和副冠混樣cDNA為模板參照孫申申等[24]的方法克隆基因，將PCR退火溫度調(diào)整為56 ℃。植物表達(dá)載體的構(gòu)建采用In-Fusion HD Cloning Kit(TaKaRa)試劑盒，根據(jù)說明書參數(shù)設(shè)計(jì)2條帶酶切位點(diǎn)的引物NtNAC2-V-F和NtNAC2-V-R(表1)，以測(cè)序正確的質(zhì)粒NtNAC2為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)在37 ℃條件下，以SpeI和AscI(NEB)雙酶切pMDC140載體，電泳檢測(cè)膠回收純化后，使用5X In-Fusion HD Enzyme Premix連接得到2×35S :: NtNAC2-GUS融合蛋白。

1.2.2生物信息學(xué)分析利用VectorNTI、ProtParam、TMHMM、SignalP、NetPhos、PONDRVL3、SOPM、SWISS-MODEL、MEGA 6.0和Blastp等生物學(xué)軟件及在線網(wǎng)站對(duì)NtNAC2蛋白的基本理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、固有無序序列位置、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，以及基于氨基酸序列的同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ)的構(gòu)建。

1.2.3NtNAC2基因的表達(dá)分析采用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，分析NtNAC2在不同處理下的表達(dá)規(guī)律和不同器官、不同花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量。設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)檢測(cè)引物NtNAC2-Q-F和NtNAC2-Q-R(表1)，內(nèi)參選用高度保守NtActin-F和NtActin-R，先進(jìn)行PCR檢測(cè)引物的準(zhǔn)確性。qRT-PCR擴(kuò)增體系參照SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒參數(shù)選取25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，36個(gè)循環(huán)數(shù)。65～95 ℃每隔0.5 ℃分析溶解曲線，檢測(cè)引物的專一性。以H2O為陰性對(duì)照，4孔重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，DPS V7.5軟件分析數(shù)據(jù)的單因素方差，Sigmaplot軟件繪圖。

1.2.4NtNAC2基因轉(zhuǎn)化煙草與分子檢測(cè)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[25]轉(zhuǎn)化煙草，將雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV1301菌株中，侵染切成1～2 cm2煙草葉盤(組培苗齡5～6周)。暗培養(yǎng)3 d后置于含抗生素10 mg/L Hyg(潮霉素)的MS培養(yǎng)基上篩選抗性芽，選取生長(zhǎng)良好的抗性芽轉(zhuǎn)入抗生素減半的1/2 MS生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，約50 d后進(jìn)行煉苗移栽。選用TransDirect Plant Tissue PCR Kit(TRAN)試劑盒提取抗性煙草植株DNA，用于PCR檢測(cè)，獲得的陽性植株幼葉用GUS染色，并在顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。進(jìn)一步提取陽性株系總RNA，煙草內(nèi)參引物選用TbActin-F和TbActin-R(表1)，RT-PCR檢測(cè)NtNAC2是否過表達(dá)。

表1 引物及其序列

注：下劃線為酶切位點(diǎn)

Note: Underlined sequences are the enzyme digest sites

1.2.5煙草種子根長(zhǎng)試驗(yàn)將鑒定的T0代陽性轉(zhuǎn)基因煙草于26 ℃溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，14 h光照/10 h黑暗，70%相對(duì)濕度，每隔3 d澆水1次，每14 d補(bǔ)充所需養(yǎng)分，直至收獲T1代種子，同時(shí)觀察不同生長(zhǎng)時(shí)期植株表型性狀。挑選顆粒飽滿的煙草種子，75%乙醇浸泡30 s，10% H2O2震蕩10 min消毒處理后，將轉(zhuǎn)基因T1代種子接種到含有Hyg的1/2 MS培養(yǎng)基，對(duì)照組野生型接種于1/2 MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)至種子萌發(fā)。選取長(zhǎng)勢(shì)較一致的幼苗分別轉(zhuǎn)移到含10μmol /L ABA、150 mmol/ L NaCl、150 mmol/L甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基中垂直培養(yǎng)7 d，以不添加任何物質(zhì)的1/2 MS培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，觀察和統(tǒng)計(jì)根系生長(zhǎng)狀況。

1.2.6煙草的高鹽和干旱脅迫處理為進(jìn)一步鑒定NtNAC2轉(zhuǎn)基因煙草在非生物脅迫下的耐受性，將潮霉素篩選得到的T1代幼苗移栽至直徑15 cm花盆，營(yíng)養(yǎng)土(泥炭土∶蛭石=3∶1)培養(yǎng)8周后，分別進(jìn)行高鹽和干旱處理，以野生型植株做對(duì)照。高鹽處理之前控水10 d，用400 mmol/L NaCl連續(xù)脅迫處理4周，每3 d澆灌200 mL，統(tǒng)計(jì)存活率，每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)20株。干旱脅迫處理4周后再?gòu)?fù)水1周，觀測(cè)植株表型；采集苗齡8周的嫩葉立即稱重(鮮重，F(xiàn)W)，于25 ℃室溫自然干燥，每隔30 min對(duì)葉片進(jìn)行稱重(干重，IW)，連續(xù)觀測(cè)3 h，最后在80 ℃下完全干燥稱量(完全干重，DW)，按照下列公式計(jì)算葉片相對(duì)失水率。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtNAC2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR克隆方法，以‘云香’水仙花為材料擴(kuò)增NAC基因全長(zhǎng)cDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到長(zhǎng)度約為1 000 bp的目的條帶(圖1)。Vector NTI序列分析顯示，全長(zhǎng)1015 bp，其完整的ORF為936 bp，編碼311個(gè)氨基酸多肽，命名為NtNAC2(GenBank登錄號(hào)為MF417802)。

2.2 NtNAC2蛋白生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析表明，NtNAC2編碼蛋白分子式為C1550H2368N422O475S21，分子量為35.19 kD，等電點(diǎn)為5.84，脂肪系數(shù)為54.65，總平均親水性為-0.648，不穩(wěn)定系數(shù)為32.74，推測(cè)其屬于親水性穩(wěn)定蛋白。無明顯跨膜和信號(hào)肽現(xiàn)象，推測(cè)NtNAC2不是膜蛋白且為非分泌型蛋白。絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)數(shù)分別為16、12、4個(gè)，說明NtNAC2蛋白以絲氨酸修飾為主，蘇氨酸或酪氨酸為輔的磷酸化修飾方式。NtNAC2蛋白C端具有較長(zhǎng)的無序結(jié)構(gòu)序列，以非折疊形式存在。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由52.24%無規(guī)則卷曲組成，還包括21.15%α-螺旋、19.87%延伸鏈、6.73%β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。同源建模預(yù)測(cè)NtNAC2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，與抗性相關(guān)的水稻SNAC1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，推測(cè)NtNAC2蛋白具有相似功能，參與抗逆性調(diào)控。

在NCBI Blastp數(shù)據(jù)庫中與其他植物的NAC氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果表明，NAC蛋白氨基酸種類、長(zhǎng)度不一致，但它們相似性較高，NtNAC2同蘆筍(XP_020276002.1)、葡萄(CAN80239.1)、大豆(ALA09294.1)、擬南芥(Q9FKA0.1)和‘云香’水仙(APX42143.1)的相似性分別為70%、74%、76%、50%和58%。利用DNAMAM對(duì)NtNAC2進(jìn)行多序列比對(duì)(圖2)，發(fā)現(xiàn)NtNAC2蛋白氨基端含有NAM保守結(jié)構(gòu)域(8～133個(gè)氨基酸殘基)，由A～E等5個(gè)子域組成，表明NtNAC2是NAC轉(zhuǎn)錄因子家族新成員。系統(tǒng)進(jìn)化樹聚為兩大類(圖3)，NtNAC2與Ⅰ類單子葉植物蘆筍(Asparagusofficinalis)、番紅花(Crocussativus)、石斛(Dendrobiumcatenatum)和桃紅蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)等親緣關(guān)系近，與Ⅱ類雙子葉植物鷹嘴豆(Cicerarietinum)、葡萄(Vitisvinifera)、黃麻(Corchoruscapsularis)和博落回(Macleayacordata)等親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，符合植物學(xué)分類結(jié)果，同時(shí)也說明NtNAC2在進(jìn)化過程中存在物種差異性。

圖1 ‘云香’水仙NtNAC2基因的克隆Fig.1 Cloning of NtNAC2 gene in‘Yunxiang’

AoNAM79．蘆筍(XP_020276002.1)；AtNAC2．?dāng)M南芥(Q9FKA0.1)；NtNAC3153．‘云香’水仙(APX42143.1)； A～E．NAM保守結(jié)構(gòu)域圖2 NtNAC2與其他NAC氨基酸序列多重比對(duì)AoNAM79．Asparagus officinalis(XP_020276002.1)；AtNAC2．Arabidopsis thaliana(Q9FKA0.1)；NtNAC3153．Narcissus tazetta‘Yunxiang’(APX42143.1)；A-E．NAM conserved domainFig.2 Alignments of NAC domain between NtNAC2 and other NAC proteins

分支上的數(shù)字表示Bootstrap重復(fù)1 000次的可信度圖3 NtNAC2與其他物種的NAC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹The number on the branches show the reliability of the bootstrap replication 1 000Fig.3 Phylogenetic relationship of NtNAC2 with other NAC members

2.3 NtNAC2基因組織器官和時(shí)空表達(dá)分析

采用qRT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)NtNAC2基因在根和葉中高表達(dá)，顯著高于鱗莖，具有一定的組織器官特異性(圖4，A)?；ò旰透惫谑切纬伤苫ㄗ钪饕钠鞴伲糠治鲲@示，NtNAC2在花發(fā)育階段花瓣和副冠的表達(dá)量逐漸升高，衰敗期達(dá)到峰值，分別為花苞期的27.94倍和37.24倍；同一發(fā)育階段不同器官的表達(dá)量存在差異，花苞期到盛花期花瓣的表達(dá)量高于副冠，而衰敗期相反，副冠表達(dá)量高于花瓣(圖4，B)。結(jié)合水仙花開花形態(tài)學(xué)觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)副冠和花瓣NtNAC2的表達(dá)量與水仙花生長(zhǎng)發(fā)育形態(tài)變化緊密相關(guān)，始花期花瓣先于副冠開放，而衰敗期花瓣發(fā)生萎蔫，副冠仍然挺立(圖5)，推測(cè)NtNAC2可能參與‘云香’水仙花花瓣的發(fā)育，同時(shí)延緩副冠的衰老。

Ⅰ．花苞期；Ⅱ．花蕾期；Ⅲ．始花期；Ⅳ．盛花期；Ⅴ．衰敗期；不同小寫字母表示差異達(dá)0.05顯著水平，下同圖4 ‘云香’水仙NtNAC2基因在不同器官(A)和花發(fā)育時(shí)期(B)的表達(dá)分析 Ⅰ．Bud；Ⅱ．Alabastrum；Ⅲ．First flowering date；Ⅳ．Full flowering date；Ⅴ．Last flowering date；Different normal letters mean the significant difference at 0. 05 level，the same as below Fig.4 Expression of NtNAC2 in different organs (A) and flower development stages (B) of ‘Yunxiang’

圖5 ‘云香’水仙花發(fā)育階段的表型Fig.5 Phenotypic in the development tage of ‘Yunxiang’

2.4 NtNAC2基因在激素和非生物脅迫下的表達(dá)分析

為探討NtNAC2基因是否響應(yīng)激素和非生物脅迫，以未經(jīng)脅迫處理(0 h)為參照，設(shè)定NtNAC2的表達(dá)量為1，qRT-PCR分析對(duì)照和不同處理下的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示(圖6)，不同脅迫處理下，同一組織葉或根中NtNAC2的表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加不同程度顯著上調(diào)；同一脅迫處理時(shí)間點(diǎn)，NtNAC2在根中的表達(dá)量高于葉片，除50 ℃處理6、12和24 h時(shí)根中表達(dá)量低于葉片，這可能與處理方法有關(guān)，根部浸泡在處理液中，最先且最直接感受到脅迫處理。

在ABA誘導(dǎo)下，1～3 h內(nèi)NtNAC2的表達(dá)量急劇上升，1 h時(shí)在葉片中達(dá)到峰值，為對(duì)照的6.18倍；3 h時(shí)在根中達(dá)到峰值，為對(duì)照的15.92倍。在MeJA誘導(dǎo)下，NtNAC2的表達(dá)量出現(xiàn)下降-上升-下降的趨勢(shì)，處理12 h時(shí)葉片中的表達(dá)量迅速上調(diào)為對(duì)照的4.58倍，24 h時(shí)根中表達(dá)量出現(xiàn)峰值為對(duì)照的7.49倍。在SA誘導(dǎo)下，3 h時(shí)葉和根中NtNAC2的表達(dá)峰分別為對(duì)照的1.77倍和1.88倍，上調(diào)表達(dá)量與其他脅迫處理相比較小。

在H2O2脅迫下，1 h時(shí)NtNAC2的表達(dá)量低于對(duì)照水平，12 h時(shí)在葉片達(dá)到峰值為對(duì)照的4.12倍，根中的表達(dá)峰出現(xiàn)較遲，48 h時(shí)上調(diào)為對(duì)照的5.92倍。在50 ℃和NaCl脅迫下，葉片和根中NtNAC2轉(zhuǎn)錄水平均在同一時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值，高溫處理6 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照的15.48倍和8.21倍；高鹽脅迫3 h達(dá)到峰值，葉片上調(diào)7.44倍，而根中上調(diào)達(dá)42.24倍。在PEG脅迫下，NtNAC2的轉(zhuǎn)錄水平均在3 h后出現(xiàn)表達(dá)峰，6 h時(shí)葉片中最高表達(dá)量為12.95倍，24 h時(shí)根中顯著上調(diào)為對(duì)照的28.51倍。

上述表明，NtNAC2在葉和根中的表達(dá)受ABA、MeJA、H2O2、50 ℃、NaCl、PEG誘導(dǎo)，SA受誘導(dǎo)程度較低，且具有時(shí)空和組織表達(dá)特異性，推測(cè)NtNAC2可能在‘云香’抗逆境脅迫方面發(fā)揮重要作用，并受ABA、MeJA、SA等激素調(diào)控。

2.5 NtNAC2轉(zhuǎn)基因煙草植株的鑒定

隨機(jī)選擇Hyg篩選出14株抗性植株，提取DNA稀釋到同一濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有10個(gè)泳道擴(kuò)增出約1 000 bp特異性條帶，與目的條帶重組質(zhì)粒的長(zhǎng)度一致，獲得10株陽性株系(圖7，A)。陽性株系GUS染色呈現(xiàn)藍(lán)色，維管束部分顏色較深(圖7，B)，這表明‘云香’NtNAC2基因已成功導(dǎo)入煙草中。選取條帶最明亮的7、11、12株系，3個(gè)株系重新命名為TP-1、TP-2和TP-3。以野生型煙草為對(duì)照，進(jìn)一步提取總RNA進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NtNAC2在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達(dá)(圖8，C)。

圖6 NtNAC2基因在激素和非生物脅迫下的相對(duì)表達(dá)Fig.6 The relative expression of NtNAC2 gene under phytohormone and abiotic stress

2.6 NtNAC2過表達(dá)煙草在模擬逆境脅迫下的根長(zhǎng)分析

選擇野生型以及3個(gè)(TP-1、TP-2和TP-3)T1代轉(zhuǎn)基因煙草株系，鑒定苗期根系的抗旱性和耐鹽性。根長(zhǎng)分析顯示，在正常生長(zhǎng)條件下(1/2 MS)，野生型和轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)沒有顯著性差異，轉(zhuǎn)基因TP-3株系根系最長(zhǎng)。逆境脅迫下野生型與轉(zhuǎn)基因植株根長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，生長(zhǎng)遲緩(圖8，A)。在ABA處理下，轉(zhuǎn)基因株系響應(yīng)外源ABA，其中TP-3根系受抑制最嚴(yán)重，為野生型的0.34 倍；在NaCl和甘露醇脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系根系發(fā)育較野生型良好，而TP-3根系最長(zhǎng)，分別為野生型的3.18倍和2.09倍(圖8，B)。結(jié)果表明，過表達(dá)NtNAC2能顯著提高煙草根系對(duì)ABA的敏感性，以及對(duì)干旱和高鹽脅迫的耐受性。

A．PCR；B．GUS染色；C．半定量RT-PCR；M．DL2000；WT．野生型；CK+．重組質(zhì)粒；1～14．Hyg篩選轉(zhuǎn)基因煙草植株；CK-．陰性對(duì)照(H2O);TP-1、TP-2和TP-3.代表轉(zhuǎn)水仙NtNAC2基因煙草株系;下同圖7 轉(zhuǎn)基因煙草植株的檢測(cè)A．PCR；B．GUS stain；C．Semi-quantitative RT-PCR；M．DL2000；WT．Wild tobacco；CK+．Recombinant plasmid；1～14．Screening transgenic tobacco plant by Hyg；CK-．Negative control(H2O); TP-1, TP-2 and TP-3 are NtNAC2 transgenic tobacco plants. The same as belowFig.7 Detection of the transgenic tobacco lines

A．不同脅迫處理7 d后根系的表型；B．根長(zhǎng)圖8 NtNAC2基因過表達(dá)煙草株系的根長(zhǎng)分析A．Phenotype of roots after 7 days of different stress treatments；B．Root lengthFig.8 Assays of root length of NtNAC2 over-express transgenic tobacco lines

2.7 NtNAC2過表達(dá)煙草在干旱和高鹽脅迫下的表達(dá)分析

過表達(dá)NtNAC2轉(zhuǎn)基因煙草T0代在充足的水肥條件下，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草沒有發(fā)現(xiàn)差異；生殖生長(zhǎng)期間，轉(zhuǎn)基因煙草花期整體提前約1周(圖9，A)。T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株經(jīng)4周高鹽處理，大部分植株葉片皺縮、枯黃，野生型存活率僅為33%，而轉(zhuǎn)基因株系存活率仍高于60%；干旱處理4周后，土壤含水量降至7%左右，植株葉片萎蔫，轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)較好，復(fù)水1周后，野生型和轉(zhuǎn)基因株系均存活，但轉(zhuǎn)基因株系長(zhǎng)勢(shì)更旺盛(圖9，B和C)。葉片經(jīng)3 h脫水處理，失水率隨測(cè)定時(shí)間延長(zhǎng)而升高，在3 h時(shí)野生型失水率達(dá)36%，而轉(zhuǎn)基因煙草失水率低于30%，其葉片失水率更低、保水性能更好(圖9，D)。結(jié)果表明，過表達(dá)NtNAC2降低逆境脅迫產(chǎn)生的損害, 增強(qiáng)了煙草對(duì)鹽和干旱的耐受性。

3 討 論

NAC轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫響應(yīng)等過程[26-27]。在本研究中，從‘云香’水仙中克隆了1個(gè)新基因NtNAC2，編碼的蛋白序列由A～E等5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成NAM保守結(jié)構(gòu)，其中子域A、C、D高度保守，而子域B、E相對(duì)變化，符合典型NAC轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)[7-8]，由此推斷NtNAC2是NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員。一些研究表明，序列相似性高的NAC可能具有相同的生物學(xué)功能，多序列比對(duì)NtNAC2與抗逆脅迫相關(guān)的‘云香’水仙NtNAC3153、擬南芥AtNAC2相似性達(dá)55%，其中‘云香’水仙NtNAC3153能被ABA、高鹽和高溫等誘導(dǎo)[21]；擬南芥AtNAC2在根和花中高水平表達(dá)，能被ABA、高鹽誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，過表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀l(fā)育，從而提高耐鹽性[28]，推測(cè)NtNAC2可能也具有與之相似的生物學(xué)功能。

A．植株開花表型；B．干旱和高鹽脅迫處理后的植株表型；C．鹽脅迫后存活率；D．葉片失水率；WT．野生型；TP．過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系；**表示轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比的極顯著性差異圖9 NtNAC2過表達(dá)煙草株系在鹽和干旱脅迫下耐受性分析A．Phenotype of plant flowering；B．Phenotype of plants under stress treatment；C．Survival rate after salt stress；D．Leaf water loss rate WT．Wild tobacco；TP．Over-expression of transgenic lines；Asterisks indicated the significant difference from WTFig.9 Tolerance analysis of NtNAC2 over-express lines under salt and drought stress

為了進(jìn)一步證明上述推測(cè)，對(duì)‘云香’水仙進(jìn)行外源激素和非生物脅迫處理，發(fā)現(xiàn)葉和根中NtNAC2轉(zhuǎn)錄水平受ABA、MeJA、SA、H2O2、50 ℃、NaCl和PEG脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且具有時(shí)空和組織表達(dá)特異性。這類似于其他抗逆境脅迫相關(guān)NAC基因在葉和根中的表達(dá)特性。如，小麥TaNAC29經(jīng)ABA、H2O2、NaCl、PEG脅迫處理后，葉和根中差異表達(dá)及上調(diào)[13，29]；紫花苜蓿MsNAC2、MsNAC3在ABA、4 ℃、PEG和NaCl脅迫處理下也表現(xiàn)出葉、根組織特異性且誘導(dǎo)表達(dá)[30-31]；野生大豆GsNAC20在4 ℃、干旱、鹽脅迫下根和葉中轉(zhuǎn)錄水平差異顯著[32]。上述NAC轉(zhuǎn)錄因子基因均已被證實(shí)為逆境響應(yīng)調(diào)控基因，由此表明NtNAC2可能參與逆境響應(yīng)，并可能受激素調(diào)控。

由于中國(guó)水仙遺傳轉(zhuǎn)化存在周期長(zhǎng)的問題，故選擇生長(zhǎng)周期較短的模式植物煙草作為遺傳轉(zhuǎn)化受體，快速鑒定NtNAC2在干旱和鹽脅迫下的耐受性。植物的根系主要用來吸收水分和養(yǎng)分，提高根系的抗旱性能更合理的分配水分，減少干旱造成的損害，提高植物在非生物脅迫下的存活率[33]。模擬逆境脅迫幼苗根系，外源ABA、NaCl和甘露醇抑制了煙草植株根系伸長(zhǎng)，高鹽和干旱脅迫苗齡4周煙草，植株葉片枯黃萎蔫，但相較于野生型的根長(zhǎng)和表型，NtNAC2過表達(dá)煙草根長(zhǎng)明顯更長(zhǎng)，葉片長(zhǎng)勢(shì)佳、失水率低，植株存活率高，抗旱和耐鹽性明顯提高。這一結(jié)果與眾多的研究保持一致，如，水稻OsNAC045[34]、水稻OsNAC063[35]、小麥TaNAC47[36]、陸地棉GhSNAC3[37]、煙草NtNAC2[38]過表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植物的根系發(fā)育，表型性狀優(yōu)良，提高了對(duì)干旱、鹽脅迫的耐受性。此外，正常生長(zhǎng)條件下，NtNAC2過表達(dá)煙草花期提前1周，與小麥TaNAC2、陸地棉GhNAC79過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株花期提前提前3～5 d類似[39-40]，該現(xiàn)象也與NtNAC2在花瓣和副冠中時(shí)空表達(dá)分析一致，可能參與調(diào)控?zé)煵莼òl(fā)育過程，是否參與調(diào)控‘云香’水仙花期，仍有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

抗旱和耐鹽是水仙分子育種的一個(gè)重要性狀，開發(fā)高抗性的水仙，旨在提高經(jīng)濟(jì)效益。本研究證實(shí)‘云香’水仙NtNAC2是提高煙草耐受性的一個(gè)潛在優(yōu)良遺傳基因資源，將繼續(xù)培養(yǎng)T1代轉(zhuǎn)基因煙草至收獲純合子T3代，進(jìn)一步測(cè)定生理指標(biāo)評(píng)價(jià)耐受性，進(jìn)而轉(zhuǎn)化‘云香’水仙，深入研究該基因的功能，以期篩選高抗性的優(yōu)良水仙類型。