轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻的構(gòu)建及其相關(guān)表型分析

李 珅，王 珂，林法明，李光豪，高俊峰，杜長青

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，鄭州450046)

木質(zhì)素是重要的植物次生代謝產(chǎn)物之一。在高等植物體內(nèi)，木質(zhì)素是僅次于纖維素的第二位最豐富的大分子有機(jī)物[1-2]。木質(zhì)素沉積在木質(zhì)部導(dǎo)管及韌皮部纖維等組織中，參與調(diào)控植物生長發(fā)育、病蟲害防御及環(huán)境適應(yīng)性等過程[3-7]。然而，植物體內(nèi)過多的木質(zhì)素含量會對造紙等工業(yè)中纖維素與木質(zhì)素的分離造成很大影響，成為造紙等產(chǎn)業(yè)的主要廢物，嚴(yán)重污染環(huán)境[8-11]。另外，飼草植物中木質(zhì)素的含量還影響牲畜的消化及營養(yǎng)吸收。因此在不影響植物正常生長發(fā)育的前提下，降低木質(zhì)素含量或改變其組成，將為解決中國的環(huán)境污染問題及提高植物品質(zhì)做出重要貢獻(xiàn)。

木質(zhì)素的降解酶系[12-16]主要分為3大類：木質(zhì)素過氧化物酶 (lignin peroxidases, LIP)、錳過氧化物酶 (manganese perxidases, MnP) 和漆酶 (laccase)。黃孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium) 被認(rèn)為是白腐真菌中木質(zhì)素降解能力最強(qiáng)的一種。一般認(rèn)為黃孢原毛平革菌只產(chǎn)生LIP和MnP，不產(chǎn)生漆酶[17]。有研究表明，黃孢原毛平革菌的LIP基因家族至少含10個(gè)以上結(jié)構(gòu)上緊密關(guān)聯(lián)的基因，分別被命名為LIP-A～LIP-J，且每個(gè)基因還有不同形式的等位基因[18-19]。自1998年將一個(gè)編碼黃孢原毛平革菌LIP的基因克隆入E.coli中成功獲得表達(dá)以來，黃孢原毛平革菌木質(zhì)素相關(guān)基因的異源表達(dá)研究發(fā)展迅速[20]。王海寬等[21]從黃孢原毛平革菌中克隆了LIPH8基因并將其導(dǎo)入甲醇畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，獲得了表達(dá)高活力木質(zhì)素過氧化物酶的酵母工程菌株，表明黃孢原毛平革菌中的這些編碼LIP的基因在木質(zhì)素降解方面可能發(fā)揮著非常重要的作用。然而，這些LIP基因在轉(zhuǎn)基因植物中的功能卻鮮有報(bào)道。

水稻既是一種重要的糧食作物，也是一種良好的研究基因功能的模式植物。本研究將黃孢原毛平革菌編碼木質(zhì)素過氧化物酶的PcLIPH8基因克隆至植物雙元表達(dá)載體pCAMBIAL-1301，構(gòu)建重組表達(dá)載體35S∷PcLIPH8并遺傳轉(zhuǎn)化水稻野生型品種Kitaake，分析其在水稻中的表達(dá)情況及對水稻木質(zhì)素含量的影響，為確定該基因在降低植物木質(zhì)素含量，改善植物品質(zhì)方面的潛在功能奠定了一定的前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

入門載體質(zhì)粒pMD-18-PcLIPH8，植物雙元表達(dá)載體pCAMBIAL-1301，野生型水稻種子(Kitaake)，均為河南省水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 研究方法

1.2.135S∷PcLIPH8植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻株系獲得利用雙酶切法，分別對攜帶SacI和NcoI酶切位點(diǎn)的入門載體質(zhì)粒pMD-18-PcLIPH8及植物雙元表達(dá)載體pCAMBIAL-1301進(jìn)行雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物并利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性菌株并送上海生工測序驗(yàn)證。提取測序正確的陽性菌株的重組質(zhì)粒35S∷PcLIPH8，電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌EHA105，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型水稻品種Kitaake的胚性愈傷組織，經(jīng)脫菌、30 mg/L潮霉素篩選、抗性愈傷分化、生根等過程，培養(yǎng)至成熟期單株收種。T3代純合株系用于下一步的表型分析。

1.2.2轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的分子鑒定利用Invitrogen公司的TRIzol試劑分別提取野生型和轉(zhuǎn)基因水稻株系幼苗的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選取質(zhì)量完好的RNA用于下一步的逆轉(zhuǎn)錄。取1 μg總RNA，利用寶生(TaKaRa)公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃冰箱保存，用于轉(zhuǎn)基因株系的鑒定。設(shè)計(jì)PcLIPH8的特異性引物所用引物均見表1，對轉(zhuǎn)基因水稻株系中的PcLIPH8表達(dá)量分析，以野生型水稻作為陰性對照。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。以水稻OsACTIN1基因作為PCR的內(nèi)參，3次生物學(xué)重復(fù)。2-ΔCt法分析qRT-PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)。半定量RT-PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳并用凝膠成像系統(tǒng)分析。

表1 引物列表

1.2.3木質(zhì)素過氧化物酶的活性測定根據(jù)木質(zhì)素過氧化物酶氧化藜蘆醇生成藜蘆醛，在310 nm處有特征吸收峰的特點(diǎn)，木質(zhì)素過氧化物酶活性具體參照Tien等[22]的方法測定。取0.1 g新鮮水稻幼苗樣品，在液氮中充分研磨，加入0.05 mol/L酒石酸鈉緩沖液(pH2.5)1 mL勻漿，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清用于木質(zhì)素過氧化物酶活性鑒定。反應(yīng)體系為5 mL，含0.05 mol/L酒石酸鈉緩沖液(pH 2.5)，1 μmol/L藜蘆醇，0.2 mmol/L過氧化氫，1 mL上清液。觀察記錄310 nm 處吸光值變化。每克鮮重樣品每分鐘氧化1 nmol 藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4木質(zhì)素含量測定根據(jù)木質(zhì)素中的酚羥基發(fā)生乙?；笤?80 nm處有特征吸收峰，且280 nm吸光值低與木質(zhì)素含量正相關(guān)的原理[23]，具體

參照Syros等[24-25]的方法測定。首先將樣品80 ℃烘干至恒重，粉碎，過40 目篩，稱取2 mg樣品置于10 mL 玻璃試管中用于測定。 向干燥物中加入500 μL 25%溴乙酰 (冰醋酸配置) 和20 μL高氯酸，封口膜密封，充分混勻，80 ℃水浴40 min，每隔10 min 震蕩1次，然后自然冷卻至室溫。加入500 μL NaOH-冰乙酸混合溶液，充分混勻，終止反應(yīng)。5 000 r/min離心10 min，取上清20 μL，加冰乙酸稀釋至1 mL。取200 μL于96孔板，測定280 nm處吸光值。以未加樣品的作為空白對照。

1.2.5轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的表型觀察在成熟期對轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系進(jìn)行表型觀察分析，包括株高、節(jié)間長度、穗長等，拍照記錄。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 35S∷PcLIPH8植物雙元表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻株系的獲得

將重組陽性菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定及測序驗(yàn)證，結(jié)果表明成功構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體35S∷PcLIPH8 (圖1，A)。將含有目的基因的重組表達(dá)載體電擊法轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，遺傳轉(zhuǎn)化野生型水稻品種 (Kitaake) 獲得潛在轉(zhuǎn)基因植株。PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子結(jié)果表明，共獲得3個(gè)獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)化子 (圖1，B)。利用半定量RT-PCR及定量RT-PCR技術(shù)，對轉(zhuǎn)基因水稻株系中PcLIPH8基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，在獲得的3個(gè)轉(zhuǎn)PcLIPH8基因獨(dú)立轉(zhuǎn)化子株系 (Ox-1、 Ox-3和Ox-6) 中PcLIPH8均有較高的表達(dá)量，而未轉(zhuǎn)基因的野生型株系中未檢測到該基因的表達(dá)，說明外源黃孢原毛平革菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因PcLIPH8在水稻中成功異源表達(dá) (圖1，C、D)。此外，我們觀察到轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻與野生型相比，在苗期表型上并無顯著性差異 (圖1，E)。

A. 35S∷PcLIPH8示意圖；B. PCR鑒定： 1～9 潛在轉(zhuǎn)基因水稻植株；C、D. 半定量和定量RT-PCR；E. 苗期表型；WT. 野生型; Ox-1、Ox-3和Ox-6. 轉(zhuǎn)基因株系圖1 植物雙元表達(dá)載體35S∷PcLIPH8的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻株系的鑒定A. Schematic representation of 35S∷PcLIPH8; B. PCR confirmation: 1-9 potential transgenic rice lines; C and D. Semi-quantitative and quantitative RT-PCR analysis; E. Phenotype analysis at seedling stage; WT. Wild-type; Ox-1, Ox-3 and Ox-6. Transgenic rice linesFig.1 Generation of plant binary expression vector 35S∷PcLIPH8 and identification of transgenic rice lines

2.2 轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的木質(zhì)素過氧化物酶活分析

為了進(jìn)一步證明PcLIPH8可以在水稻中異源表達(dá)，以10 d齡轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻幼苗為材料，提取植物總蛋白，進(jìn)行木質(zhì)素過氧化物酶活性測定。以未轉(zhuǎn)基因10 d齡野生型水稻幼苗作為對照。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻幼苗的木質(zhì)素過氧化物酶活性顯著高于野生型水稻幼苗，增幅3.06%～5.07%，表明將PcLIPH8基因遺傳轉(zhuǎn)化入水稻中提高了其木質(zhì)素過氧化物酶活性 (圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的木質(zhì)素含量分析

以相同培養(yǎng)條件下的野生型水稻株系作為對照，進(jìn)一步分析幼苗期及成熟期轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻的木質(zhì)素含量變化。結(jié)果表明，無論是幼苗期還是成熟期，轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻幼苗的木質(zhì)素含量均顯著低于野生型水稻幼苗，苗期降低11.44%～14.97%，成熟期降低13.83%～20.05% (圖3)，表明將PcLIPH8基因異源表達(dá)入水稻中通過提高其木質(zhì)素過氧化物酶活性有效降低了木質(zhì)素含量。

**表示野生型與轉(zhuǎn)基因株系之間差異極顯著(P<0.01)；下同圖2 轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的LIP活性分析** indicate significant differences at 0.01 level between wild-type and transgenic rice lines; The same as belowFig.2 LIP activity assay of transgenic PcLIPH8 rice lines

2.4 轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的株高變化

對轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻植株的成熟期表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的株高顯著高于未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻株系，株高較野生型增加約30% (圖4，A、B)。對其穗長及各節(jié)間長度比較分析表明，轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的穗長及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ節(jié)間均顯著長于野生型對照，Ⅱ節(jié)間在轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系和野生型水稻株系中并無顯著性差異 (圖4，C、D)，說明轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系株高的增加主要是由于穗長及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ節(jié)間的增長決定。

2.5 轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的生物量變化

對成熟期轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻植株的生物量進(jìn)行了相關(guān)表型觀察分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的穗粒數(shù)顯著高于野生型水稻，穗谷粒數(shù)增多110%～120% (圖5，A～C)，然而轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的谷粒長度較野生型變短6.67%～7.15% (圖5，D、E)。為分析這些農(nóng)藝性狀變化對產(chǎn)量及生物產(chǎn)量的影響，進(jìn)一步比較了千粒重變化，轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的千粒重降低，較野生型水稻減小12.86%～13.34% (圖5，F(xiàn))， 而單株的生物量卻增大18.61%～22.97% (圖5，G)。表明PcLIPH8基因轉(zhuǎn)入水稻雖然在一定程度上降低了千粒重，籽粒變小，但卻極大地增加了穗粒數(shù)及生物量，為利用該基因改善農(nóng)作物的生物產(chǎn)量奠定了一定的前期基礎(chǔ)。

圖3 不同時(shí)期轉(zhuǎn)PcLIPH8水稻株系的木質(zhì)素含量比較Fig.3 Lignin content of transgenic PcLIPH8 rice lines at different stages

A、B. 株高表型及統(tǒng)計(jì)分析, Bar=20 cm；C、D. 穗及節(jié)間長度表型及統(tǒng)計(jì)分析, Bar=10 cm. PL.株高；Ⅰ～Ⅳ. 第1～4節(jié)間圖4 轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻株系的株高及節(jié)間長度分析A and B. Plant height phenotype and statistical analysis, Bar=20 cm；C and D. Panicle and internode length phenotype and statistical analysis, Bar=10 cm. PL. Plant height; Ⅰ-Ⅳ. The 1st, 2nd, 3rd and 4th internodeFig.4 Analysis of plant height and internode length of transgenic PcLIPH8 rice lines

A. 穗表型分析，Bar=5 cm；B、C. 穗粒數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析，Bar=5 mm；D、E. 谷粒長度分析；F. 千粒重分析；G. 單株生物量分析圖5 轉(zhuǎn)PcLIPH8水稻株系的生物產(chǎn)量分析A. Panicle phenotype analysis, Bar=5 cm; B and C. Panicle grain number and statistical analysis, Bar=5 mm; D and E. Grain length analysis; F. Thousand grain weight analysis; G. Biological production analysisFig.5 Biological production analysis of transgenic PcLIPH8 rice lines

3 討 論

木質(zhì)素作為一種重要的次生代謝物，在植物生長、發(fā)育、抗病蟲等方面具有十分重要的意義[26]。然而，過多的木質(zhì)素以及不同的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)組成大大制約了一些植物的利用效率及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此在不影響植物正常生長發(fā)育的前提下，降低其木質(zhì)素含量或改變其組成，已成為植物木質(zhì)素研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

隨著現(xiàn)代植物生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因研究大大加快了對基因功能的揭示。研究表明將一些編碼某些重要酶類的基因異源表達(dá)至高等植物體內(nèi)可顯著改善植物的某些表型。如杜長青等[27]將真菌Sclerotiniasclerotiorum的谷氨酸脫氫酶基因SsGDH在水稻中異源表達(dá)可增強(qiáng)對除草劑的抗性。因此，通過基因工程技術(shù)降低植物木質(zhì)素含量可能是提高植物經(jīng)濟(jì)價(jià)值，減少環(huán)境污染的一條有效途徑。鐘天秀等[28]從華南象草中克隆了木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因Pp4CL并將其轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)能顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素含量。黃孢原毛平革菌是白腐真菌的模式菌種，對木質(zhì)素具有極強(qiáng)的降解能力。黃孢原毛平革菌對木質(zhì)素的強(qiáng)降解能力主要取決于其產(chǎn)生的2種酶：LIP和MnP。碳源、氮源、氧氣、微量元素等外界因素均能顯著影響黃孢原毛平革菌木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生[29]。LIP是第一個(gè)從黃孢原毛平革菌中被發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶，在木質(zhì)素降解中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。LIP基因排列緊密且高度保守，以基因家族形式存在。然而，這些LIP基因在轉(zhuǎn)基因植物中的功能卻并不十分清楚。

本研究將編碼黃孢原毛平革菌木質(zhì)素過氧化物酶的PcLIPH8基因?qū)胍吧退酒贩NKitaake中異源表達(dá)，分析其對水稻木質(zhì)素含量的影響及相關(guān)表型變化，結(jié)果表明將外源PcLIPH8基因?qū)胨竞螅娠@著提高轉(zhuǎn)基因水稻的木質(zhì)素過氧化物酶活性，增強(qiáng)其木質(zhì)素降解能力，從而有效降低木質(zhì)素含量。成熟期的田間表型分析表明，盡管導(dǎo)入外源PcLIPH8基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因水稻的千粒重在一定程度上降低，籽粒變小，但是轉(zhuǎn)基因水稻株高顯著變高，單株籽粒數(shù)增多，總生物量顯著增加。此外，轉(zhuǎn)PcLIPH8基因水稻的莖節(jié)較野生型水稻品種變脆變薄，可能會在一定程度上影響水稻的抗倒伏性。盡管如此，這些結(jié)果充分說明了外源PcLIPH8基因在降低植物木質(zhì)素含量，提高生物產(chǎn)量等方面的潛在功能，為下一步利用該基因降低某些特定植物的木質(zhì)素含量，提高其生物產(chǎn)量，從而提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值奠定了一定的前期基礎(chǔ)。