中間錦雞兒CiPUB22基因克隆與功能分析

岳文冉，于秀敏，岳俊燕，楊 杞，韓曉東，王瑞剛，李國婧

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古自治區(qū)抗逆植物遺傳資源利用與分子改良科技創(chuàng)新團隊，呼和浩特 010018)

泛素/26S蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome pathway, UPP)是一類重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，它能有效地調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)的選擇性降解[1]，也是細胞進行自身功能調(diào)控的重要機制，包括兩個連續(xù)的過程：第一步，在ATP存在下，泛素化系統(tǒng)將底物蛋白泛素化；第二步，26S蛋白酶體降解泛素化的靶蛋白[2]。UPP途徑主要由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)和26S蛋白酶體組成，其中，泛素連接酶E3在底物的選擇性降解過程中起到主要的作用[3]。

泛素連接酶E3的主要功能是識別將要被泛素化的靶蛋白，使活化的泛素接近特異靶蛋白的賴氨酸(Lys)，從而將泛素轉(zhuǎn)移到底物上去。在擬南芥中，編碼E3基因的數(shù)量約1 400個[4]，水稻中有1 300個[5]。植物中目前已經(jīng)鑒定出的E3共分成5類[6]：HECT (homologous to E6-APC-terminus)、RING (really interesting new gene)/U-box、APC (anaphase promoting complex，后期促進復(fù)合物)、SCF (Skpl/Cullin or CDC53/F-box protein)復(fù)合體和CUL3-BTB。

U-box泛素連接酶是最早發(fā)現(xiàn)的E3泛素連接酶，結(jié)構(gòu)域最早從酵母UFD2 (ubiquitin fusion degradation protein 2)中發(fā)現(xiàn)，含有70多個保守的氨基酸，是一種泛素鏈延長因子[7]。U-box是一種改造過的RING結(jié)構(gòu)域，其含有保守組氨酸和半胱氨酸，通過分子間作用力整合金屬離子穩(wěn)定高級結(jié)構(gòu)。目前，在擬南芥中有64個基因編碼含有U-box的E3泛素連接酶[8]，水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了77個[9]。

已有的研究表明，植物U-box型E3泛素連接酶參與對植物生長發(fā)育、生物及非生物脅迫響應(yīng)等過程中關(guān)鍵步驟的控制[10]。近年來，已有很多關(guān)于PUB22和其同源基因PUB23的功能報道。擬南芥2個同源的U-box型E3泛素連接酶PUB22和PUB23與RPN12a互作并可以泛素化RPN12a，進而來調(diào)控植物對干旱脅迫的響應(yīng)過程[11]。辣椒(Capsicumannuum) CaPUB1 (putative U-box protein 1)，與擬南芥PUB22和PUB23同源性分別為51%與52%，研究發(fā)現(xiàn)，CaPUB1能夠與RPN6互作，通過體外泛素化RPN6來調(diào)控植物對干旱和高鹽脅迫響應(yīng)[12]。Seo D H等[13]研究發(fā)現(xiàn)PUB22和PUB23在調(diào)控干旱脅迫響應(yīng)過程中是不依賴ABA的，但是其調(diào)控機制還不清楚。Cho S K等[14]研究表明PUB22和PUB23能泛素化并降解RNP6。Zhao J F等[15]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥PUB22和PUB23通過泛素化降解ABA受體PYL9 (pyrabactin resistance-like)負調(diào)控擬南芥對干旱的耐受性。除此之外，PUB22和PUB23還參與PAMP (pathogen-associated molecular patterns)信號途徑[16]和MPK3 (mitogen-activated protein kinase3)引起的免疫響應(yīng)[17]。

中間錦雞兒(Caraganaintermedia)屬于豆科蝶形花亞科錦雞兒屬多年生落葉灌木，具有耐旱、耐寒、耐高溫、耐鹽堿等特性，是干旱草原、荒漠地帶的優(yōu)良固沙和水土保持植物；除此之外，中間錦雞兒還有飼用價值和藥用價值，也是生物質(zhì)能源和造紙材料[18-19]。本研究在中間錦雞兒干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組文庫中找到1條E3泛素連接酶編碼基因的全長cDNA序列，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其屬于U-box型E3泛素連接酶PUB22。利用熒光定量PCR技術(shù)對CiPUB22在脫水、干旱、鹽和ABA等處理下的表達進行了定量分析。并通過構(gòu)建植物表達載體，將CiPUB22在擬南芥中過表達，對轉(zhuǎn)基因純合體株系在種子萌發(fā)過程中對鹽和滲透脅迫的耐受性進行了初步分析。為進一步探究CiPUB22基因在中間錦雞兒響應(yīng)逆境脅迫過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及植物處理方法

中間錦雞兒種子采于內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市四子王旗，播種于營養(yǎng)土和蛭石(1∶2)的混合土中，置于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的溫室中進行培養(yǎng)。

選1個月苗齡長勢一致的植株進行脫水、NaCl和ABA處理。將苗從土中小心取出，洗凈分別置于濾紙、含300 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA溶液中處理，分別在處理后的0、1、3、6、12、24和48 h進行取樣，每個時間點取3株植物的地上部分，液氮速凍，-80 ℃保存。每種處理均進行3次生物學(xué)重復(fù)實驗。

干旱處理：植株正常生長1個月，最后一次澆水1 d后取樣作為對照，之后停止?jié)菜?，每? d取樣1次，干旱16 d后復(fù)水，復(fù)水2 d后再取樣，取樣時間點分別為0、3、6、9、12、15和17 d (16F)，取樣方法同上。

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana) Columbia-0生態(tài)型(Col-0)由本實驗室保存，植物表達載體pCanG-HA由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所謝旗研究員惠贈，大腸桿菌DH5a及農(nóng)桿菌GV3101由本實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄利用Trizol法提取中間錦雞兒總RNA。用超微量核酸蛋白測定儀(美國Quawell-超微量分光光度計Q5000)對RNA濃度進行測定，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，選取質(zhì)量好的RNA進行cDNA第一鏈的合成，按試劑盒(全式金，AT311-03)說明書進行操作。

1.2.2不同脅迫處理下的表達分析根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得的基因序列，利用軟件Primer 5設(shè)計引物F-CiPUB22-Q (TCAGAAAAGGTAACAA-AAGCGACA)和R-CiPUB22-Q (TTCAGCTCTTCCCTCAGCACA)。采用SYBR GreenⅠ熒光染料法檢測，利用LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(Roche公司)進行擴增。反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa公司)，上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，稀釋模板5 μL，DEPC水4.2 μL，總體積20 μL。反應(yīng)程序為： 95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，40個循環(huán)，實驗結(jié)果用2-ΔΔCt方法計算。

所用內(nèi)參引物為qCiEF1α-F (CAAAAAGTCCCCTCGTTGTCTC) 和qCiEF1α-R (AGCAATC-GTTCTTCCTAATGATCTAA)；qAtEF1α-F (AGAA-GGGTGCCAAATGATGAG)和qAtEF1α-R (GGA-GGGAGAGAGAAAGTCACAGA)。

1.2.3基因克隆與表達載體構(gòu)建以中間錦雞兒1個月苗齡幼苗的cDNA為模板，根據(jù)pCanG-HA表達載體的多克隆位點，設(shè)計含有SalⅠ和SacⅠ酶切位點的特異引物F-CiPUB22 (GCGTCGACATGGATGAGATCGATGTTCCT，下劃線為SalⅠ酶切位點)和R-CiPUB22 (GCGAGCTCTTTCACACATAATTAGGGTACGA，下劃線為SacⅠ酶切位點)進行PCR擴增，擴增條件為：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性15 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min， 30個循環(huán)；72 ℃補充延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生物公司)回收目的片段，并連入pEASY-Blunt Simple 載體中(北京全式金生物公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，菌落PCR及酶切驗證重組子，菌液送測序，將驗證正確的質(zhì)粒連入表達載體pCanG-HA中，進行菌落PCR及酶切驗證，將驗證正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取陽性克隆進行PCR與測序驗證，本實驗所用引物及測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.4擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化通過浸花法將重組質(zhì)粒pCanG-CiPUB22轉(zhuǎn)化野生型擬南芥[20]，把收取的種子種在含有25 mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基中篩選陽性植株，篩選得到T3代純合體株系。提取純合體株系RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實時熒光定量PCR對轉(zhuǎn)基因純合體株系表達量進行檢測，選取表達量較高的3個株系進行后續(xù)實驗。

1.2.5脅迫處理下種子萌發(fā)率檢測擬南芥種子先用75%乙醇滅菌10 min，再用無水乙醇滅菌10 min，待種子晾干后分別種在含有150 mmol/L NaCl、1 μmol/L ABA、400 mmol/L甘露醇和對照的1/2MS培養(yǎng)基中，每個株系55顆種子，4 ℃同步化處理3 d，取出置于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的溫室中進行培養(yǎng)，24 h后開始統(tǒng)計萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 CiPUB22基因的克隆和表達載體構(gòu)建

分析顯示中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得的E3泛素連接酶編碼基因，具有完整的開放閱讀框和部分UTR序列。因此，根據(jù)pCanG-HA表達載體設(shè)計含有SalⅠ和SacⅠ酶切位點的特異引物F-CiPUB22和R-CiPUB22，利用中間錦雞兒cDNA為模板，進行PCR擴增，得到目的片段(圖1, A)。將克隆得到的序列片段連入pEASY-Blunt-Simple 克隆載體中，將測序驗證正確的序列用SalⅠ和SacⅠ酶切后連入表達載體pCanG-HA中，將重組表達載體pCanG-CiPUB22轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆菌落質(zhì)粒，用SalⅠ和SacⅠ酶切(圖1, B)，結(jié)果表明酶切片段正確，重組載體構(gòu)建成功。將驗證正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取陽性克隆進行PCR驗證，結(jié)果如圖1, C所示。

2.2 CiPUB22基因序列分析

克隆得到的CiPUB22基因的cDNA序列，包含1 260 bp開放閱讀框，起始密碼子ATG，終止密碼子TGA，編碼419個氨基酸(圖2)。將氨基酸序列在NCBI上進行BlastP比對，發(fā)現(xiàn)其具有U-box型結(jié)構(gòu)域，與苜蓿(Medicagotruncatula) PUB23蛋白(XP_013450220.1)、鷹嘴豆(Cicerarietinum) PUB22蛋白(XP_004494254.1)、木豆(Cajanuscajan) PUB22蛋白(XP_020225250.1)、擬南芥PUB22 (NP_190813.1)和PUB23蛋白(OAP08906.1)相似性分別為84%、84%、81%、58%和58%，說明克隆得到的該基因?qū)儆赨-box型基因，因此將其命名為CiPUB22。利用MEGA5鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)，CiPUB22與苜蓿PUB23和鷹嘴豆PUB22蛋白聚類到一起，序列比對結(jié)果顯示蛋白序列相似度分別為84%，親緣關(guān)系最近。

2.3 CiPUB22基因表達分析

利用熒光定量PCR對CiPUB22基因在不同脅迫處理下的表達模式進行分析，干旱脅迫處理12 d后CiPUB22基因的表達量達到最高水平，約為未處理時表達量的2.5倍，15 d后逐漸下降(圖4, A)。脫水脅迫處理1 h后CiPUB22表達量上升到最高水平，達到未處理的12倍左右，3 h后表達量開始逐漸下降，12 h達最低，低于未處理的表達量，24 h基本恢復(fù)到未處理時的表達水平。在NaCl脅迫處理后，CiPUB22基因在1 h后表達量達最高約為未處理的35倍左右，3 h后呈逐漸下降趨勢。在ABA處理1 h后，CiPUB22基因表達量最高約為未處理的7倍，但3 h后表達量下降，基本與未處理的表達量一致，6 h后低于未處理的表達量(圖4, B)。這些結(jié)果表明CiPUB22的轉(zhuǎn)錄水平受非生物脅迫誘導(dǎo)，推測CiPUB22可能參與中間錦雞兒抵抗非生物脅迫的分子機制。

A. CiPUB22, M. DL10000; 1和2. CiPUB22 cDNA; B. pCanG-CiPUB22重組載體酶切驗證; 1.重組載體對照; 2. Sal Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切結(jié)果; M. DL5000; C. pCanG-CiPUB22菌落PCR驗證; 1～4. 單克隆; M. DL5000圖1 pCanG-CiPUB22表達載體構(gòu)建A. CiPUB22, M. DL10000; 1, 2. CiPUB22 cDNA. B. Identification of pCanG-CiPUB22 digested by restriction enzyme. 1. Vector control; 2. Digest with Sal Ⅰ and Sac Ⅰ; M. DL5000; C. Identification of pCanG-CiPUB22 by colony PCR; 1-4. Random single colony; M. DL5000Fig.1 The construction of pCanG-CiPUB22 recombinant vector

圖3 CiPUB22與其他植物相關(guān)蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CiPUB22 and other related proteins

2.4 CiPUB22轉(zhuǎn)基因純合體表達分析

將重組植物表達載體pCanG-CiPUB22轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，篩選出具有卡那霉素抗性的T3代陽性純合植株8株，提取這些株系的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用基因特異引物F-CiPUB22和R-CiPUB22進行PCR鑒定，如圖5, A所示，以野生型擬南芥cDNA為模板沒有擴增出目的條帶，而中間錦雞兒和8個轉(zhuǎn)基因株系均擴增出目的條帶，表明CiPUB22基因在轉(zhuǎn)基因株系中表達，利用qRT-PCR對8個轉(zhuǎn)基因株系的表達水平進行檢測，如圖5, B所示，選取表達量最高的3個株系T3-6、T3-19和T3-24進行后續(xù)實驗分析。

2.5 CiPUB22轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率檢測

將野生型擬南芥和3個過表達株系的種子，分別種在含有0、150 mmol/L NaCl、1 μmol/L ABA和400 mmol/L甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基中，統(tǒng)計種子萌發(fā)情況。在1/2MS培養(yǎng)基中，3個過表達株系的萌發(fā)率與野生型一致(圖6, A和E)，1 μmol/L ABA處理第4天時，野生型萌發(fā)率為97%，3個過表達株系的萌發(fā)率分別為90%、75%和82%(圖6, B和F)。在含有150 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基中，萌發(fā)第5天時野生型的萌發(fā)率為94%，3個過表達株系的萌發(fā)率分別為86%、61%和66%(圖6, C和G)。在400 mmol/L甘露醇處理下，3個過表達株系的萌發(fā)率均低于野生型(圖6, D和H)。以上結(jié)果表明：異源表達CiPUB22基因降低了擬南芥種子萌發(fā)階段對鹽、滲透脅迫和ABA的耐受力。

圖4 qRT-PCR檢測各種處理條件下CiPUB22基因的表達Fig.4 The expression of CiPUB22 under different treatments detected by qRT-PCR

A. CiPUB22轉(zhuǎn)基因株系RT-PCR鑒定: M. DL2000; C-. 陰性對照(擬南芥cDNA);C+. 陽性對照(中間錦雞兒cDNA); B. qRT-PCR鑒定CiPUB22轉(zhuǎn)基因株系表達量圖5 CiPUB22轉(zhuǎn)基因株系驗證與表達水平檢測A. RT-PCR identification of CiPUB22 transgenic Arabidopsis lines: M. DL2000; C-. Negative control (Arabidopsis cDNA); C+. Positive control (Caragana intermedia cDNA); B. qRT-PCR analysis of CiPUB22 expression in CiPUB22 transgenic Arabidopsis linesFig.5 Identification and expression analysis of CiPUB22 transgenic Arabidopsis lines

A～D.野生型和過表達株系萌發(fā)率統(tǒng)計; E～H. 對照, 1 μmol/L ABA, 150 mmol/L NaCl 和400 mmol/L甘露醇處理野生型和過表達株系生長情況, 圖片為生長第6天拍照圖6 不同處理下轉(zhuǎn)基因株系與野生型萌發(fā)率檢測A-D. Seed germination rates of the wild-type and CiPUB22 transgenitic lines. E-H. Phenotypes of the wild-type and CiPUB22 transgenic lines on 1/2MS medium supplemented with or without 150 mmol/L NaCl, 1 μmol/L ABA and 400 mmol/L mannitol. Photographs were taken 6 days after the end of stratificationFig.6 Germination assays of the transgenic lines and wild type under different treatments

3 討 論

環(huán)境脅迫，如干旱、鹽堿、極端溫度等嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。植物受到脅迫以后會激活一系列生理反應(yīng)過程來應(yīng)對脅迫，泛素化過程是真核生物所特有的選擇性降解體內(nèi)蛋白的過程，生物脅迫和非生物脅迫都會誘導(dǎo)泛素化過程發(fā)揮功能，而E3泛素連接酶在選擇性降解靶蛋白中發(fā)揮重要作用，因此對E3泛素連接酶的研究已經(jīng)成為了熱點。

已有實驗證明，擬南芥PUB22和PUB23兩個同源U-box型E3泛素連接酶基因，其轉(zhuǎn)錄水平受非生物脅迫誘導(dǎo)，但是對ABA不敏感[12]。在本實驗中，通過Blast分析發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆趐lant U-box型E3泛素連接酶PUB22基因，CiPUB22受脫水、干旱和鹽等脅迫的不同程度的誘導(dǎo)與報道的結(jié)果一致，說明CiPUB22基因參與響應(yīng)干旱和鹽脅迫，可能與植物抗逆脅迫有關(guān)。前人報道PUB22不受ABA處理誘導(dǎo)[12]，本實驗發(fā)現(xiàn)CiPUB22基因在ABA處理1 h后，表達量最高約為未處理的7倍左右， 3 h后表達量下降基本與未處理的表達量一致，6 h后低于未處理的表達量。說明CiPUB22基因能夠受ABA誘導(dǎo)，這一結(jié)果與前人報道不一致，還有待于進一步研究。

ABA在植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用，包括調(diào)控種子發(fā)育與抑制種子萌發(fā)[21]，已有研究證明，很多U-box型E3泛素連接酶參與種子萌發(fā)過程，如AtPUB18 和AtPUB19是2個同源性最高的蛋白，AtPUB18 或者AtPUB19任意一個基因突變以后與野生型相比，對ABA和鹽抑制的種子萌發(fā)都沒有任何變化；但是pub18pub19雙突變體種子萌發(fā)則表現(xiàn)出對ABA和鹽抑制不敏感的表型[13]；pub44和pub43的突變體種子萌發(fā)表現(xiàn)出對ABA抑制的不敏感表型[22]等。種子萌發(fā)率實驗中發(fā)現(xiàn)，在150 mmol/L NaCl和400 mmol/L甘露醇處理后，過表達株系的萌發(fā)率低于野生型，說明CiPUB22減弱了轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)階段對鹽和滲透脅迫的耐受力。在本研究中發(fā)現(xiàn)，ABA處理以后過表達株系的萌發(fā)率低于野生型，說明CiPUB22增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥對ABA的敏感性。目前還沒有報道證明CiPUB22基因在種子萌發(fā)過程中的功能，其具體作用機制還需要進一步驗證。