叢枝菌根真菌(AMF)對星油藤根腐病的抗性研究

唐 燕 葛立傲 普曉蘭 馬煥成 伍建榕

(1.西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200000)

星油藤 (Plukenetiavolubilis) 又稱印加果，是大戟科 (Euphorbiaceae) 的一種木質(zhì)藤本植物，因果形為四角形、五角形或六角形，因此中國科學(xué)院西雙版納植物園將其命名為星油藤[1-2]。2006年，中國科學(xué)院院長路甬祥從秘魯將星油藤引種到中國科學(xué)院西雙版納植物園，栽培成功。目前，星油藤已在云南省引種示范近70 hm2[3]。星油藤種子含有大量的不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)，還有多種維生素和生育酚，故具有較高的研究價(jià)值[4-5]。但是，由于大量的人工種植，星油藤的病害日趨嚴(yán)重，星油藤的主要病害分為地上部分和地下部分。地上部分病害還可以通過物理或化學(xué)防治等措施進(jìn)行防御，而地下部分病害主要為根腐病，既不能為人們預(yù)先發(fā)現(xiàn)，也難以控制，只有當(dāng)星油藤葉片變色時(shí)才得以發(fā)現(xiàn)[6-8]。導(dǎo)致星油藤根腐病的病原菌具有多樣性，不但真菌病原可以侵染，細(xì)菌也可侵染。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，星油藤根腐病的主要病原菌為尖孢鐮刀菌 (Fusariumoxysporum)[9]，已成為其最為嚴(yán)重的病害之一，也是影響星油藤產(chǎn)業(yè)化的重要障礙[3]。

菌根是土壤中的菌根真菌與高等植物的根系形成的一種共生體，是自然界中一種普遍的植物共生現(xiàn)象，大多數(shù)植物包括苔蘚、蕨類、裸子植物、被子植物都能形成菌根[10]。菌根分為泡囊-叢枝菌根 (VAM/AM)、外生菌根 (ECM) 等7種類型[11]。叢枝菌根真菌 (AMF) 是廣泛存在于土壤生態(tài)系統(tǒng)中的一類有益微生物，可以與陸地上90%以上的維管植物形成共生體[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，AMF與寄主植物形成共生關(guān)系后，能改善土壤理化特性、增加植物養(yǎng)分和水分的吸收與利用、增強(qiáng)植物抗逆性[14-15]、增加產(chǎn)量[16]還能能誘導(dǎo)植物對土傳病原物產(chǎn)生抗病性[17-18]。研究表明，叢枝菌根真菌能夠減輕一些土傳病原真菌、孢囊線蟲、根結(jié)線蟲對植物造成的危害[19-20]；另外，叢枝菌根真菌雖不全部都可以產(chǎn)生泡囊，但可以全部產(chǎn)生叢枝，改變植物根系的結(jié)構(gòu)，當(dāng)病原菌侵入植物根系后，叢枝菌根真菌共生體可以促進(jìn)植物根系增長、增粗，使根尖表皮加厚、細(xì)胞層數(shù)增多，從而促進(jìn)植物的抗病性，減緩病原體侵染植物的過程[21]。

云南省西雙版納傣族自治州是我國星油藤主要的種植區(qū)，也是星油藤根腐病的主要發(fā)生區(qū)，然而西雙版納有我國唯一的熱帶雨林自然保護(hù)區(qū)，因此對病蟲害不能采用化學(xué)防治措施，最好通過生物防治的方法來探討星油藤的病蟲害防治，以保證西雙版納的森林健康和生態(tài)安全。本研究主要以西雙版納星油藤人工栽培區(qū)為研究地點(diǎn)，調(diào)查星油藤根圍叢枝菌根真菌孢子的密度以及根系侵染率對星油藤根腐病發(fā)病率和發(fā)病程度的關(guān)系，為星油藤的病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地點(diǎn)

本研究在2015年11月至2016年5月在云南省西雙版納傣族自治州開展，該地地處東經(jīng)99°56′～101°50′，北緯21°08′～22°36′，多為中低山和丘陵區(qū)。

1.2 發(fā)病率和病情指數(shù)調(diào)查

對西雙版納星油藤根腐病進(jìn)行發(fā)病率調(diào)查、病情指數(shù)調(diào)查以及根系和根際土壤的采集，用自封袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行孢子的篩選以及菌根的侵染檢測。分別在云南省西雙版納傣族自治州東部、西部、南部、北部以及中部地區(qū)5個(gè)星油藤種植地塊進(jìn)行樣本采集，每個(gè)采樣地的發(fā)病地塊與健康地塊分別隨機(jī)選取15株星油藤，共150株，然后對150株不同發(fā)病程度的星油藤和不發(fā)病地塊星油藤進(jìn)行地上部分調(diào)查和地下部分采樣。地下部分采樣包括星油藤的須根系及其周圍的根際土壤。

采用趙仕光等方法對星油藤的根腐病病害進(jìn)行分級[22]，就是通過觀察星油藤根部的腐爛情況與生長長勢情況進(jìn)行分級 (表1)，計(jì)算病情指數(shù)和發(fā)病率。

(1)

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)×調(diào)查總株×100%

(2)

1.3 叢枝菌根真菌孢子測定

1.3.1叢枝菌根真菌孢子的分離

在所有健康地塊和發(fā)病地塊樣品中分別隨機(jī)選取25株土樣，對上述每株星油藤的根際土壤進(jìn)行濕篩沉淀法分離叢枝菌根真菌孢子，首先去除表層1 cm厚的雜物，挖4～20 cm深的土壤剖面，收集根際土壤約2 kg，裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室中讓其自然風(fēng)干后于常溫下保存，備用。

將采集的根際土壤用濕篩沉淀法進(jìn)行處理，首先稱取風(fēng)干的根際土壤20 g，加入無菌水500 mL，攪拌，浸泡過夜。過夜后的土壤懸浮液分別通過20、100、140、200、300目的篩子，反復(fù)用無菌水進(jìn)行沖洗[23]。再分別通過加入濾紙的布式漏斗過濾，在體視顯微鏡下分別統(tǒng)計(jì)4個(gè)篩面上的孢子。

1.3.2叢枝菌根真菌孢子密度的計(jì)算

將統(tǒng)計(jì)過的4個(gè)篩面的孢子數(shù)進(jìn)行相加再除以20，得到每個(gè)土樣的孢子密度。

1.3.3叢枝菌根真菌孢子的鑒定

在體視顯微鏡下，利用解剖針將單個(gè)孢子挑取到載玻片上，在顯微鏡下觀察單個(gè)孢子的顏色、大小；將單個(gè)孢子壓破，觀察孢壁的層數(shù)、厚度、壓迫的開口類型等。利用顯微拍照技術(shù)對單個(gè)孢子進(jìn)行拍照，利用 《VA菌根真菌鑒定手冊》 和西弗吉利亞大學(xué) (http://invam.caf.wvu.edu) 的網(wǎng)站上所提供的孢子形態(tài)，對孢子進(jìn)行鑒定[24-25]。

1.4 叢枝菌根真菌對星油藤根系的侵染率測定

1.4.1根樣的采集

對星油藤進(jìn)行采集主根系和須根系，將根系剪成2 cm放入加有1/2的FAA (70%的乙醇90 mL、福爾馬林5 mL、冰醋酸5 mL，稀釋1倍) 的青霉素小瓶中，放入4 ℃的冰箱中保存。

1.4.2星油藤根系的透明染色

將根樣從FAA中取出，用無菌水進(jìn)行沖洗干凈 (4～5次為宜)，放入15 mm × 15 mm的試管中，加入15%的KOH，水浴2 h進(jìn)行解離，從水浴鍋中取出，自然冷卻，用無菌水清洗4～5次，用2%的乳酸進(jìn)行酸化20 min，清洗，加入0.05%的苯胺藍(lán) (乳酸333 mL、甘油333 mL、蒸餾水333 mL、苯胺藍(lán)0.5 g) 進(jìn)行染色，水浴1 h，用乳酸進(jìn)行洗凈。在光學(xué)顯微鏡下觀察叢枝菌根真菌的侵染情況。利用顯微拍照技術(shù)進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)計(jì)算侵染率[24-26]。

1.4.3叢枝菌根真菌侵染率計(jì)算

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 根系的侵染率與星油藤根腐病發(fā)病率的關(guān)系

通過對星油藤根系的透明染色，可以觀察到幾乎每一根段均有菌根真菌的侵染，但侵染情況不定。在被侵染的根段中可以看到叢枝菌根真菌的2種典型結(jié)構(gòu)：一種是菌絲無隔膜，呈二叉分枝狀的叢枝 (圖1a)；另一種是菌絲較粗，具有明顯的泡囊結(jié)構(gòu) (圖1b)。

圖1根系的透明染色
Fig.1 The transparent color of root

依據(jù)表2計(jì)算病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)，調(diào)查的150株的發(fā)病指數(shù)達(dá)到43。在33株無病正常的星油藤中發(fā)現(xiàn)大量的叢枝和泡囊，菌絲的侵染率達(dá)到90%。而21株地上部分整株葉枯近死亡的星油藤中菌絲的侵染率只有13%，基本沒有發(fā)現(xiàn)泡囊和叢枝的存在。

2.2 菌根真菌孢子密度與星油藤根腐病發(fā)病率的關(guān)系

通過表3發(fā)現(xiàn)，正常星油藤的孢子密度明顯高于發(fā)病的星油藤孢子密度，而且隨著病級的增加，孢子密度呈現(xiàn)減少的趨勢。當(dāng)孢子密度小于3時(shí)，植株病級達(dá)到Ⅴ級，星油藤基本不具有抗病性，基本接近死亡。當(dāng)孢子密度大于6時(shí)，少數(shù)星油藤病級為Ⅰ級，但也能生長，其余大多數(shù)為0級，是正常植株。

通過計(jì)算發(fā)病率得到發(fā)病地塊與健康地塊星油藤根部叢枝菌根真菌孢子密度與根部病害發(fā)病率的關(guān)系。在發(fā)病地塊中，當(dāng)孢子密度低于2時(shí)，星油藤發(fā)病率達(dá)到60%，且發(fā)病嚴(yán)重。在健康地塊中，叢枝菌根真菌孢子密度達(dá)到6時(shí)，發(fā)病率僅為4%，星油藤可以健康生長。

表2 發(fā)病情況、發(fā)病率及菌根侵染率Table 2 The morbidity,incidence of root rot and mycorrhizal infection rate

表3 孢子密度與病級統(tǒng)計(jì)Table 3 The statistics of spore density and disease degree

2.3 叢枝菌根真菌孢子的種類

通過星油藤土壤孢子的分離，共分離出1屬3種AMF，分別為摩西球囊霉 (Glomusmosseae) (圖2a)、幼套球囊霉 (Glomusetunicatum) (圖2b) 和縮球囊霉 (Glomusconstrictum) (圖2c)。

摩西球囊霉：幼嫩的孢子乳白色，成熟時(shí)淺黃—黃褐色，表面光滑，直徑110～290 μm。孢壁3層，厚2～7 μm，孢子壁1層 (W1) 無色透明， Melzer′s試劑中染成粉紅色；表面時(shí)常脫落形成顆粒狀，在成熟的孢子中脫落；孢子壁2層 (W2) 無色透明，不易觀察；孢子壁3層 (W3) 淺黃、黃褐色，層積壁。孢子內(nèi)含物為大小不等的油滴或顆粒。連孢菌絲漏斗形，連點(diǎn)寬8～25 μm，連點(diǎn)處菌絲壁稍增厚；連孢菌絲底部漏斗形，有厚彎隔，是該種孢子的特征性結(jié)構(gòu)[27]。

幼套球囊霉：孢子圓形或近圓形，表面光滑，黃色、黃褐色，直徑70～120 μm。孢壁2層，壁厚4～13 μm。外層W1無色透明，易逝壁；內(nèi)壁W2為層狀壁，黃褐色。成熟孢子通常不見外層壁。連孢菌絲大多一條，無色易斷，孢壁延伸入連孢菌絲一段距離，基部增厚至3～3.5 μm，連點(diǎn)寬7.5～12 μm，連點(diǎn)孔由隔封閉或由壁增厚封閉。內(nèi)含物顆粒狀[27]。

縮球囊霉：孢子球形或近球形，深紅棕或黑棕色，孢壁光滑透亮，有時(shí)附著有碎屑，孢子直徑80～160 μm。孢壁1層，為層狀壁，厚6～12 μm，深黃棕、深紅棕或黑棕色。連孢菌絲在連點(diǎn)處縊縮，寬11～15 μm，連點(diǎn)處壁增厚，封閉孔口或僅留一狹小通道，連點(diǎn)下方連孢菌絲膨大至17～19 μm寬，連孢菌絲顏色自連點(diǎn)處向下由黑紅棕逐漸變淺至淺黃棕至淺黃。連孢菌絲通常向一側(cè)彎曲，有時(shí)在連孢菌絲變寬部位下方有一隔，隔下有細(xì)分枝[27]。

圖2叢枝菌根真菌孢子種類
Fig.2 The spore types of arbuscular mycorrhizal fungi

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在分離15株接近死亡的星油藤土壤中，只發(fā)現(xiàn)單屬單種，并不具有叢枝菌根真菌的多樣性。在18株健康的星油藤土壤中，分離出1屬3種，并且，幼套球囊霉 (G.etunicatum) 是該株的優(yōu)勢種。

3 結(jié)論與討論

3.1 叢枝菌根真菌菌根侵染率和孢子密度與根腐病的關(guān)系

星油藤根腐病是由20多種土傳病原真菌、細(xì)菌復(fù)合侵染導(dǎo)致，發(fā)病植株生長發(fā)育受阻、產(chǎn)量和品質(zhì)都受到嚴(yán)重的影響，已經(jīng)成為制約星油藤產(chǎn)量發(fā)展的主要障礙。而叢枝菌根真菌可與星油藤共生，提高星油藤的抗病性。本研究發(fā)現(xiàn)，正常的星油藤根中有大量的叢枝和泡囊，同時(shí)菌絲的侵染率很高，發(fā)病的星油藤根中基本沒有泡囊和叢枝的存在，同時(shí)菌絲的侵染率也低；并且正常星油藤的孢子密度明顯高于發(fā)病的星油藤孢子密度，而且隨著病級的增加，孢子密度減少。以上說明了叢枝菌根真菌與星油藤的抗根腐病有著密切的關(guān)系。但目前還未發(fā)現(xiàn)前人利用叢枝菌根真菌與星油藤共生達(dá)到抵抗根腐病的研究，但是有研究觀察到健康三七 (Panaxnotoginseng) 的AMF侵染率明顯高于有根腐病的三七，表明AMF提高了三七對根腐病的抗病能力[28]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AMF可通過促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收、生長，調(diào)控病害相關(guān)酶活性，提高紫花苜蓿對煙色織孢霉 (Microdochiumtabacinum) 引致的根腐病抗性[29]。

3.2 叢枝菌根真菌孢子的優(yōu)勢種與多樣性與星油藤根腐病的關(guān)系

叢枝菌根真菌的優(yōu)勢種、多樣性與星油藤根腐病也有一定的關(guān)系，研究表明：根系中具有叢枝菌根優(yōu)勢種和多樣性較為豐富的星油藤抵抗根腐病的能力越強(qiáng)，發(fā)病率越低。由此可見，叢枝菌根真菌的多樣性可提高星油藤的抗病性，減少其發(fā)病率。也有學(xué)者觀察到對加工番茄根系接種摩西球囊霉 (G.mosseae) 和根內(nèi)球囊霉 (G.intrara-dices) 菌種后，其根系侵染率分別為60.50%和47.50%，對加工番茄根腐病的防效為63.42%和21.22%[30]。Thygesen等[31]也用根內(nèi)球囊霉 (G.in-traradices)，近明球囊霉 (G.claroideum) 分別接種豌豆，發(fā)現(xiàn)2種AMF都能減輕豌豆根腐病病害。所以我們可以通過接種叢枝菌根真菌來預(yù)防星油藤根腐病的發(fā)生，提高星油藤的抗病性。

3.3 叢枝菌根真菌與病原菌相互作用

從叢枝菌根真菌在對健康地塊植株和發(fā)病地塊植株的侵染率來看，病原菌的存在降低叢枝菌根真菌的侵染率。原因可能是病原菌的侵害導(dǎo)致植物的生長長勢衰弱，對叢枝菌根真菌的營養(yǎng)供應(yīng)減少，叢枝菌根真菌生長減緩，導(dǎo)致侵染率下降。叢枝菌根真菌與病原菌都是異養(yǎng)型生物，都是依靠寄主植物提供營養(yǎng)才得以生存。而叢枝菌根真菌的存在必然會減少病原菌的營養(yǎng)供應(yīng)，會對病原菌的生長起到一定的限制作用。

綜合分析可知，叢枝菌根真菌的孢子密度、叢枝菌根真菌的多樣性勢必會提高星油藤的抗病性，促進(jìn)星油藤根系的發(fā)育和營養(yǎng)生長。而叢枝菌根真菌誘導(dǎo)植物抗病性是一個(gè)影響植物根系的結(jié)果而影響植物功能和植物生理生化的復(fù)雜過程，包括影響根系周圍土壤微生物的組成、病原物侵染植物的侵染位點(diǎn)等多個(gè)方面。并且不同栽培模式對油茶 (Camelliaoleifera) 土壤微生物及酶活性的影響也不一樣，對它新梢生長、單株產(chǎn)果量及出油率也有顯著影響[32]，所以同樣是油料植物的星油藤，不同栽培模式是否會影響土壤根系微生物的組成，從而影響叢枝菌根真菌種類的多樣性以及植物的抗病性。而叢枝菌根真菌具體通過哪種機(jī)制提高植物的抗病性、以及這些機(jī)制的相互關(guān)系,需要進(jìn)一步的探究。只有深入了解這些機(jī)制以及內(nèi)在的聯(lián)系，才能成功的將生物防治運(yùn)用到植物的生產(chǎn)中來。