藏藥二十五味珊瑚丸治療阿爾茨海默病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

胡賢達

(中國藏學(xué)研究中心北京藏醫(yī)院科教處，北京 100029)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一種復(fù)雜的慢性神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力功能性減退及認知功能下降，并伴有人格和情感障礙等。AD是老年人最常見的癡呆和死亡原因，影響著全世界4 400萬人的健康[1]。同時，隨著全球社會老齡化的加劇，其發(fā)病率不斷上升。目前，對AD發(fā)病機制的認識尚不清晰，也缺乏行之有效的治療辦法。而隨著藥物臨床試驗的不斷失敗，AD單靶點藥物的開發(fā)前景越發(fā)黯淡[2]。二十五味珊瑚丸(ByudMar25, BM25)作為具有悠久臨床應(yīng)用歷史經(jīng)典藏藥驗方，對于AD展現(xiàn)出良好的治療效果，并被《中華人民共和國藥典》及《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》等法定標準所收錄[3-4]。然而，由于BM25藥物配伍及化學(xué)組分十分復(fù)雜，其藥理作用機制一直難以探究，阻礙了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

此前，由南開大學(xué)、清華大學(xué)、江西中醫(yī)學(xué)院與北京藏醫(yī)院合作完成了BM25的藥代動力學(xué)研究，并對于其主要組分及入血成分進行了深入研究[5]。本文在此基礎(chǔ)上，通過反向藥效團匹配法，對BM25主要入血成分的潛在靶點進行預(yù)測，并結(jié)合生物信息學(xué)手段，對以上靶點的所涉主要生物學(xué)功能及細胞信號通路進行聚類分析。以系統(tǒng)地探討B(tài)M25抗AD可能的藥理作用機制。

1 方法

1.1化合物數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建通過查閱文獻，收集BM25的主要入血化合物信息。通過NCBI PubChem數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合ISIS/Draw 2.5軟件，繪制化合物二維結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)出為.mol文件[6]。隨后利用Open Babel 2.4.1軟件，將其轉(zhuǎn)換成三維立體結(jié)構(gòu)，并輸出后綴為.mol2的文件[7]。

1.2靶點預(yù)測將BM25入血化合物的立體結(jié)構(gòu)上傳至PharmMapper服務(wù)器，采用默認參數(shù)對上述配體進行檢測[8]。并利用DGA數(shù)據(jù)庫，將通過反向分子對接得到的蛋白進行比對，篩選AD相關(guān)靶點蛋白，通過UniProt數(shù)據(jù)庫，將蛋白名轉(zhuǎn)換為其編碼基因的名稱[9-10]。選擇各化合物匹配分數(shù)最高的10個靶點所對應(yīng)的基因進行生物信息學(xué)分析。

1.3生物信息學(xué)分析將上述基因集導(dǎo)入GeneAnalytics軟件，注釋各潛在靶標對應(yīng)基因所涉的生物學(xué)功能及分子作用通路[11]。將化合物名稱、靶蛋白對應(yīng)的基因名稱、主要生物學(xué)功能及信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，繪制BM25的藥理作用網(wǎng)絡(luò)[12]。

2 結(jié)果

2.1BM25主要入血成分的作用靶點預(yù)測文獻顯示，BM25共有35個主要成分或藥物代謝物可從血中檢出，其中包括19個原型藥物及16種藥物代謝物。由于其中3種化合物與另外3種互為異構(gòu)體的化合物結(jié)構(gòu)相似度較高，預(yù)測結(jié)果基本一致，因而本文共收集了BM25的32種化合物作為其主要入血成分進行分析，其中包括19個原型藥物及13種藥物代謝物(Fig 1)。通過對上述32個化合物進行反向藥效團匹配，以及AD相關(guān)靶點的篩選，并選擇各化合物分數(shù)最高的10個蛋白作為主要靶點，得到78個潛在靶點(共320次)，見Fig 2。

2.2BM25的主要生物學(xué)功能及分子信號通路分析生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，BM25對于AD的潛在靶點所對應(yīng)的基因，主要聚類于炎癥與免疫(158次)、凋亡與自噬(59次)、β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)表達及清除(56次)共3類生物學(xué)功能，以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)(130次)、胰島素(insulin)(124次)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)(92次)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)(46次)、缺口蛋白(Notch)(32次)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin)(30次)、神經(jīng)酰胺(ceramide)(29次)、無翅相關(guān)整合位點(wingless-related integration site, Wnt)(8次)及鈣離子(calcium)(5次)共9條細胞信號傳導(dǎo)通路(Fig 2)。因此推測，BM25可能主要通過作用于MAPK、Insulin及mTOR等分子通路，發(fā)揮其抗炎癥、抗凋亡、抗Aβ表達及沉積等藥理作用，進而干預(yù)AD的進程。

3 討論

自1906年發(fā)現(xiàn)首例AD患者至今已經(jīng)百余年，雖然人類對AD的發(fā)病機制有了不斷深入的了解，然而其發(fā)病機制仍不明確，仍缺乏有效的治療方法。目前，F(xiàn)DA共批準5種治療AD的藥物用于臨床，其中4種為乙酰膽堿酯酶抑制劑(actylcholinesterase inhibitor, AChEI)類藥物，另一種為NMDA受體激動劑。然而，沒有任何一種藥物對于AD進程有逆轉(zhuǎn)或延緩的作用。目前，臨床上主要采用社會心理及家庭看護干預(yù)手段，配合AChEI類藥物及神經(jīng)保護因子緩解AD癥狀。隨著干細胞技術(shù)的興起，以及炎癥與免疫學(xué)說的出現(xiàn)等，神經(jīng)干細胞治療與免疫細胞治療也愈發(fā)受到重視。然而，目前仍未有具有明確應(yīng)用前景的、能夠有效治療AD的單靶點藥物出現(xiàn)，而具有多效性特點的傳統(tǒng)藥物在AD治療中的應(yīng)用，則受到了越來越多的關(guān)注[2]。

Fig 1 Structural formulae of main blood components after oral administration of Byur dMar Nyer lNga Ril Bu

Fig 2 Network pharmacology-based prediction on mechanism of Tibetan medicine Byur dMar Nyer lNga Ril Bu against AD

整體觀和辨證論治是包括藏醫(yī)學(xué)在內(nèi)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的普遍特征。對于復(fù)雜的慢性病的治療，采用傳統(tǒng)醫(yī)藥手段往往能夠收獲更好的效果。然而，由于傳統(tǒng)藥物通常成分十分復(fù)雜，且每一種化合物往往能夠調(diào)控多個靶點，因此通過常規(guī)的單一藥物對單一靶點的經(jīng)典研究方法，很難理清傳統(tǒng)藥物復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)，而作用機制不明也成為其廣泛臨床應(yīng)用的最大阻礙之一。近年來，隨著系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展, 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的研究模式，被引入天然活性化合物的篩選及多效性藥物的藥理機制研究中。其主要研究目的為探討藥物組分與靶點之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，其核心研究內(nèi)容為收集藥物組分信息，并通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)與計算化學(xué)的方法，研究各組分潛在作用靶點，進而通過生物信息學(xué)手段，分析其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及潛在的藥理功能。其系統(tǒng)化的研究方法與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的整體論思想殊途同歸，尤其適合闡明復(fù)雜藥物及復(fù)雜疾病間的相互關(guān)系。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)正逐漸成為傳統(tǒng)藥物研究中的有力工具，用于分析藥物作用機制、天然活性化合物或活性成分群的篩選，以及新適應(yīng)癥的發(fā)現(xiàn)等工作。

BM25是由18世紀藏醫(yī)藥學(xué)名家帝瑪爾·丹增彭措研制，并沿用至今的用于包括AD在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的經(jīng)典驗方。由珊瑚、珍珠、珍珠母、青金石、朱砂、龍骨、爐甘石、磁石、腦石、麝香、木香、丁香、沉香、紅花、 訶子、禹糧土、芝麻、葫蘆、獐牙菜、紫菀花、西紅花、藏菖蒲、打箭菊、榜那及甘草組成[3-4]。臨床研究證實，BM25對于各種神經(jīng)性疼痛、癲癇、腦卒中、多發(fā)性周圍神經(jīng)病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病均具有良好的治療效果[13]。動物實驗顯示，BM25能抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元變性和星形膠質(zhì)細胞的過度激活，HE染色發(fā)現(xiàn)，其能夠減輕神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的損傷，行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)其能夠改善模型受損的學(xué)習(xí)、記憶能力，表明其對于AD也具有潛在的治療作用[14]。

本文基于BM25的入血成分，通過反向藥效團匹配法預(yù)測其潛在的作用靶點，并將靶點與疾病進行了關(guān)聯(lián)。確認BM25具有通過作用于不同靶點，共同發(fā)揮抗AD的潛能。此外，通過對靶點功能的聚類分析發(fā)現(xiàn)，BM25抗AD的藥理作用機制可能與調(diào)控MAPK、Insulin及mTOR等細胞信號傳導(dǎo)通路，干預(yù)患者腦組織中炎癥與免疫、凋亡與自噬、Aβ的表達及清除等生物學(xué)功能有關(guān)。BM25的藥理作用機制在分子水平的實驗研究相對較少，主要包括杜文兵等[13]發(fā)現(xiàn)，BM25能夠降低偏頭痛大鼠模型血漿中神經(jīng)遞質(zhì)NO和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的含量；Liu等[15]報道，BM25能夠抑制人神經(jīng)母細胞瘤細胞SHSY-5Y中磷酸化NF-κB p65的水平。而根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，BM25的入血成分具備與NOS及p65的磷酸化直接相關(guān)的糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase, GSK)-3β的潛能，可見文中分析結(jié)果具備一定的可信度和參考價值。然而，限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的特點，以及相關(guān)研究的缺乏，其真實的藥理作用仍需要通過實驗手段進行證實，但本研究對于相關(guān)基礎(chǔ)及臨床實驗的設(shè)計及開展能夠起到一定程度的指導(dǎo)作用。

(致謝: 本研究在北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院圖書館完成。)