歐前胡素抗抑郁作用及機制研究

鄭星星，劉嘉輝，劉明輝，程 穎，曹艷君, 2

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1. 西部資源生物與生物技術(shù)教育部重點實驗室、2. 陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室，陜西 西安 710069)

抑郁癥是一種情感障礙類疾病，在中國醫(yī)學(xué)屬于抑郁類病癥的范疇，從青少年時期開始發(fā)病，具有高發(fā)病率和高自殺率，嚴重威脅人類健康。其發(fā)病機制不明，致使抗抑郁的藥物療效有限[1]。近年來，中醫(yī)、中藥作為研究抑郁的發(fā)病機制以及抗抑郁藥用資源，引發(fā)了人們廣泛的關(guān)注[2]。盡管抑郁癥的確切病因及病理機制尚不清楚，但在前人的研究基礎(chǔ)上，已形成了多種有關(guān)抑郁癥的神經(jīng)生物學(xué)假說，包括單胺能假說、神經(jīng)退行性假說、細胞因子假說等，其中基于5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)系統(tǒng)的單胺類遞質(zhì)失調(diào)假說在研究抑郁發(fā)生機制中起到重要作用[3]。

5-HT作為一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦皮層及神經(jīng)突觸內(nèi)含量極高，必須通過相應(yīng)受體的介導(dǎo)才能產(chǎn)生作用。大量研究表明，5-HT1A受體在抑郁的發(fā)病與抗抑郁行為中起調(diào)節(jié)作用，可能作為抗抑郁藥的作用靶點[4-5]。腦內(nèi)5-HT1A受體能調(diào)節(jié)應(yīng)激適應(yīng)過程，而且對應(yīng)激刺激引起的情感障礙具有保護作用。與5-HT1A受體不同的是，5-HT轉(zhuǎn)運體只有一種5-HT轉(zhuǎn)運蛋白(serotonin transporters, 5-HTT)。5-HTT清除突觸間隙的5-HT含量，決定了突觸后受體介導(dǎo)信號的量以及持續(xù)時間，在5-HT神經(jīng)傳遞系統(tǒng)具有重要作用[3]。也正因如此，5-HTT的表達也與抑郁癥密切相關(guān)。氟西汀作為一種選擇性的5-HT重攝取抑制劑，在抑郁癥、抑郁障礙等方面都有較好應(yīng)用[6]。因此，在本實驗中，將氟西汀作為陽性藥使用。歐前胡素(imperatorin, IMP)是從中草藥白芷中提取分離的呋喃香豆類化合物，用于保持傳統(tǒng)抗癲癇藥劑的活性，改善認知損傷，此外還有抗驚厥和鎮(zhèn)靜催眠作用[2,7-8]。目前，IMP作用于情緒障礙的研究有所進展，但在產(chǎn)前應(yīng)激(prenatal stress, PS)引起的抑郁樣作用未見報道。本實驗擬通過產(chǎn)前束縛應(yīng)激模型，建立子代抑郁模型，探究IMP對PS子代大鼠的抗抑郁作用及相關(guān)機制。

1 材料

1.1實驗動物Sprague-Dawley(SD)大鼠，購買于西安交通大學(xué)動物研究中心。在西北大學(xué)SPF動物房飼養(yǎng)，使用許可證號：SYXK(陜)2010-004，室溫控制在(23～27)℃，濕度50%～60%，晝夜各12 h，提供充足的水和食物。

1.2藥物與試劑IMP(陜西慧科植物開發(fā)有限公司)，經(jīng)高效液相色譜測定，其純度>98%；氟西汀(常州四藥,生產(chǎn)批號：201711161)；5-HT ELISA試劑盒(美國ADL公司); RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司)。

1.3儀器光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司); 酶標儀(美國PerkinElmer公司)；大鼠束縛應(yīng)激容器(西安玻璃制品廠); 攝像機(日本東京Sony公司); 實時定量PCR儀(Bio-Rad公司); 離心機(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1動物分組與造模SD大鼠以3 ∶1將♀大鼠(250±20)g與♂大鼠(280±20)g進行合籠。次日清晨進行陰道涂片檢測，如果涂片有精子呈陽性，記為妊娠d 0，懷孕的♀鼠單獨飼養(yǎng)。在♀大鼠懷孕的d 14～20進行單獨的束縛應(yīng)激(將孕鼠放入1個瓶底和瓶蓋都開孔、通氣的透明瓶子里，1 d 3次，每次45 min，每次束縛應(yīng)激間隔時間不少于2 h，直徑6.8 cm)。♂子代大鼠分為5組，每組8只。分別是正常組、模型組、陽性組、IMP低、高劑量組(15、30 mg·kg-1·d-1)。正常組與模型組每天灌服等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(CMC-Na)，陽性組灌服鹽酸氟西汀溶液(10 mg·kg-1·d-1)。給藥組從子代出生后d 30開始，灌胃給藥4周，使用0.5%的CMC-Na溶解IMP。

2.2糖水偏好實驗測定前禁水、禁食24 h，測定4 h飲用2%蔗糖溶液的量[9]，糖水偏好的計算公式為：糖水消耗量/總液體消耗×100%。

2.3強迫游泳實驗水溫(23～25) ℃的圓桶(桶高50 cm，直徑20 cm)水深40 cm，強迫游泳8 min，記錄大鼠的不動時間(s), 大鼠在水中處于被動漂浮，同時停止掙扎達到3 s以上，則認為大鼠為不動狀態(tài)。不動時間的計算公式為：不動時間/總時間×100%。

2.4曠場實驗曠場箱為白線5×5等分(150 cm×150 cm×49.5 cm，四壁涂為黑色，底部綠色), 箱子的中心區(qū)域(3×3=9的方塊)再細分為1個大的中心區(qū)域和8個小的中心區(qū)域，每次放入1只大鼠在小的中心區(qū)域的同一側(cè)，觀察大鼠的行為，記錄5 min內(nèi)大鼠在中心區(qū)域逗留的時間，穿越總格子數(shù)、穿越中心格子數(shù)、直立次數(shù)以及理毛次數(shù)。

2.5ELISA實驗行為學(xué)結(jié)束后，對5組♂子代大鼠斷頭取腦，分離出前額葉皮層和海馬，并用液氮冰凍，-80 ℃保存。按照ELISA說明書，使用相對應(yīng)定量的抗體對5-HT含量進行測定，將樣品加入到預(yù)先涂有一抗的96孔板的每一個孔里，之后每個孔加入生物素結(jié)合試劑和酶結(jié)合試劑，將孔板在37 ℃孵育30 min，將板子用蒸餾水清洗5次，并用酶標儀測量，數(shù)據(jù)以ng·g-1的蛋白含量顯示。

2.6RNA提取和實時定量PCR總RNA用TRIzol法從組織中提取，使用納米級分光光度法進行定量。每個mRNA樣品使用隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取1 μg合成cDNA鏈。使用SYBR Green real-time PCR Master Mix擴增5-HTT、5-HT1AR PCR產(chǎn)物。大鼠特異性引物5-HTT 正向序列：5′- GGCGGAGATGAGGAATGAAG-3′，反向序列：5′-AAGAAGATGATGGCAAAGAACG-3′；5-HT1AR正向序列：5′- CCACGGCTACACCATCTAC-3′，反向序列：5′- TGACAGTCTTGCGGATTCG -3′。

3 結(jié)果

3.1IMP對PS子代大鼠體質(zhì)量的影響如Fig 1所示，與對照組相比，IMP給藥組或者氟西汀組的子代♂大鼠體質(zhì)量在d 0、7、14、21、28并沒有明顯變化。

Fig 1 Chemical structure(A) and effect of IMP on bodyweight in prenatally stressed male offspring rats(B)

3.2IMP對PS子代大鼠糖水偏好的影響如Tab 1所示，與對照組相比，PS組子代♂大鼠對2%的糖水消耗百分比明顯減少(P<0.01)。IMP組和氟西汀組的子代♂大鼠糖水偏好百分比明顯增長(P<0.01)，IMP給藥組與氟西汀組比較差異無顯著性。

Tab 1 Effects of IMP on sucrose-preference test in prenatally stressed male

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

3.3IMP對PS子代大鼠強迫游泳的影響如Tab 2所示，與對照組相比，PS組不動時間和不動時間百分比明顯增加(P<0.01)。IMP組和氟西汀組的子代♂大鼠不動時間和不動時間百分比都明顯減少(P<0.05，P<0.01)，IMP給藥組與氟西汀組比較差異無顯著性。

3.4IMP對PS子代大鼠曠場實驗的影響如Tab 3所示，PS組穿越總格子數(shù)、穿越的中央格子數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)較對照組明顯減少(P<0.01)。

Tab 2 Effect of IMP on forced-swimming test in prenatally stressed male

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

IMP組和氟西汀組的子代♂大鼠穿越總格子數(shù)、穿越的中央格子數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)均明顯增加(P<0.05，P<0.01)，IMP給藥組與氟西汀組比較差異無顯著性。

3.5IMP對PS子代大鼠海馬和前額葉皮層中5-HT濃度的影響如Fig 2所示，PS組的5-HT濃度明顯低于對照組(P<0.01)。IMP給藥4周后，能夠明顯逆轉(zhuǎn)PS子代大鼠海馬和前額葉皮層組織中5-HT的濃度(P<0.05，P<0.01)，與氟西汀組的結(jié)果有著相同的趨勢，差異無顯著性。

Fig 2 Effect of IMP on 5-HT concentration in hippocampus andfrontal cortex of prenatally stressed male

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsPS

3.6IMP對PS子代大鼠海馬和前額葉皮層中5-HTT、5-HT1ARmRNA表達的影響如Fig 3所示，與對照組相比，PS組5-HT1AR mRNA表達明顯減少，而5-HTT mRNA的表達明顯增加(P<0.05，P<0.01)。與PS組相比，IMP給藥4周后，5-HT1AR mRNA表達明顯增加，而5-HTT mRNA表達明顯減少(P<0.05，P<0.01)，IMP給藥組與氟西汀組比較差異無顯著性。

4 討論

隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們長期承受來自工作、生活、家庭等各種壓力，過度長期應(yīng)激可增加人們精神負擔、不良情緒和疾病的易患性，特別是某些特定生理階段應(yīng)激對健康的影響更為明顯。妊娠期是婦女生活的重要時期，是女性應(yīng)激的易患期。臨床資料顯示，新生兒及成年后焦慮、抑郁、認知障礙等疾病發(fā)病率的不斷升高，與母代在妊娠期遭受慢性應(yīng)激有關(guān)。有研究表明，孕婦處于長期情緒困擾，可增加子代焦慮、抑郁等情緒障礙的發(fā)病率[10]。動物實驗也表明，產(chǎn)前應(yīng)激后的子代大鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮及抑郁樣行為。IMP是一種廣泛存在于白芷、川芎、香菜等中藥及食材中的呋喃香豆素類化合物，已被證明具有抗炎、舒張血管、抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠等功效[11]。在本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，IMP組或者陽性藥氟西汀組的子代♂大鼠體質(zhì)量在d 0、7、14、21、28并無明顯變化。通過4周的IMP灌胃給藥，可明顯上調(diào)子代抑郁♂大鼠的糖水偏好度、強迫游泳不動時間、穿越總格子數(shù)、穿越中間格子數(shù)、直立和理毛次數(shù)。提示IMP可明顯改善♂子代大鼠抑郁樣行為。

Tab 3 Effect of IMP on open-field test in prenatally stressed male

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 3 Effect of IMP on 5-HTT(A) and5-HT1AR(B) mRNA expression in hippocampus andfrontal cortex of prenatally stressed male

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsPS

抑郁病的發(fā)病機制與遺傳、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、激素異常、不良社會心理因素等一系列因素相關(guān)，由這些因素導(dǎo)致的5-HT缺乏是普遍認可的抑郁癥發(fā)病機制之一。由于5-HT1A受體被看作應(yīng)激調(diào)節(jié)過程的一個重要媒介，在應(yīng)激引起的抗精神紊亂過程中起保護作用。與此同時，5-HT的攝取過程由5-HTT控制，所以研究5-HT1AR、5-HTT對了解抑郁癥發(fā)病機制有重要意義。5-HT濃度的增加有助于海馬神經(jīng)形成，從而使抑郁癥得以改善，促進抑郁樣行為的恢復(fù)[12]。多數(shù)研究和抑郁癥自殺者的尸檢結(jié)果證實，在抑郁癥患者腦內(nèi)，分布于皮質(zhì)-邊緣系統(tǒng)的突觸后5-HT受體表達降低，結(jié)合能力下降[4]。本實驗結(jié)果表明，IMP可以提高海馬及前額葉皮層中5-HT濃度及5-HT1A受體的mRNA表達，并下調(diào)5-HTT mRNA表達。IMP對5-HTT的下調(diào)可能與降低5-HT的再攝取有關(guān)，從而增加5-HT的濃度。這表明IMP抗抑郁作用可能與5-HT的濃度以及5-HT1AR、5-HTT mRNA的表達量有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，IMP可以抑制尼古丁引起的焦慮，并改善學(xué)習(xí)記憶行為[13]。此外，IMP還可通過改變谷氨酸釋放，改善癲癇發(fā)作[14]。IMP不僅廣泛存在于常見中草藥白芷中，而且在烹調(diào)香料如香菜、茴香中也有較高含量。本研究結(jié)果表明，IMP可明顯降低產(chǎn)前應(yīng)激引起的子代抑郁樣行為，其機制可能與5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，提示IMP可能可以作為一個潛在用于預(yù)防和治療抑郁樣行為的藥物。