13-甲基十四烷酸對大鼠腦缺血后腦水腫的影響

馮 曉，陳世妹，張文榮

(1. 廈門大學附屬第一醫(yī)院思明分院大內(nèi)科，福建 廈門 361000；2. 廈門市社會福利中心，福建 廈門 361000；3. 三明醫(yī)學科技職業(yè)學院基礎醫(yī)學部，福建 三明 365000)

惡性腦缺血中風在腦血管疾病中以高死亡率(80%)和嚴重臨床癥狀為特點，而缺血后腦水腫的形成使神經(jīng)功能損傷加速惡化，顱內(nèi)壓升高，腦血流量減少，最終導致腦疝和病人死亡[1]。然而腦缺血后腦水腫發(fā)生的機制尚不十分清楚，因此，目前臨床治療僅限于對癥處理?，F(xiàn)有研究認為，腦缺血后腦水腫的發(fā)生機制有腦微循環(huán)障礙、腦能量代謝障礙、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)障礙、自由基增加、鈣超載、膜分子結構紊亂等學說。腦缺血后造成BBB 結構的完整性破壞，使其通透性增加，引發(fā)腦水腫，導致BBB進一步破壞，擴大腦梗死體積，造成嚴重的神經(jīng)功能損傷，這是缺血性腦損傷的重要病理基礎[2]。13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoic acid, 13-MTD)是一種末端支鏈飽和脂肪酸，天然存在于細菌和某些真菌的細胞膜上，是細菌胞膜的重要成分[3]。13-MTD被首次發(fā)現(xiàn)存在于Bacillus subtilis菌屬胞膜的脂肪酸組成成分中，有維持膜的流動性和膜功能作用。13-MTD作為細胞膜成分能嵌入膜脂質結構中，可通過調(diào)節(jié)膜的組成而影響細胞功能，在脂質雙分子層中脂肪酸含量較高時，對哺乳動物細胞膜有膜穩(wěn)定作用。然而，13-MTD對腦缺血后大鼠BBB是否也具有膜穩(wěn)定作用，從而抑制腦缺血后腦水腫的形成，進而抑制大鼠腦缺血后神經(jīng)功能損傷尚不清楚。本研究擬通過觀察13-MTD對大鼠腦缺血后腦水腫的形成和BBB功能改變相關蛋白表達的影響，從水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)角度探討其機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 Sprague-Dawley (SD)大鼠，♂，體質量230～270 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.1.2試劑 13-MTD由廈門大學藥學院合成，濃度10 g·L-1，以脂質體包裹；伊文思藍(Evan’s blue, EB)，廈門泰京生物技術有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，分析純，上?；瘜W試劑公司生產(chǎn)，用PBS配制成2% TTC工作液，4 ℃避光保存；AQP4多克隆抗體(H-19)，Santa Cruz公司；SABC-羊抗兔IgG試劑盒，武漢博士德公司；引物由上海生工生物工程技術公司合成；TRIzol，Invitrogen公司；免疫組化試劑盒，福州邁新。

1.1.3儀器 光學顯微鏡及攝像系統(tǒng)(日本Olympus公司)；LGR16-W型低溫高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；超低溫冰箱(日本SANYO)；酶標儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene Genius公司)；9700型PCR擴增儀(ABI公司)。

1.2制備大鼠大腦中動脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型線栓法制備大鼠MCAO模型[4-5]。動物術前禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛0.3 mL·kg-1腹腔麻醉，仰臥固定后頸部酒精消毒，正中切口約3 cm，分離兩側甲狀腺，暴露右側胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區(qū)，鈍性分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，并小心分離迷走神經(jīng)。分離頸外動脈分支甲狀腺上動脈，頸內(nèi)動脈分支枕動脈，分別電凝。充分游離頸外動脈，將頸外動脈吊線，在距離頸總動脈分叉大約1 cm處結扎近心端，電凝遠心端。用無創(chuàng)小動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈遠心端，將頸外動脈殘端牽向外下方，使之與頸內(nèi)動脈呈一條直線，在頸外動脈殘端距頸總動脈分支約3 mm處剪一小口，將栓線自頸外動脈插入頸內(nèi)動脈，將栓線與血管稍作結扎防止血液溢出，打開頸內(nèi)動脈上的動脈夾，輕柔緩慢的將栓線向前推進約(18.5±0.5)mm(自分叉處計)，遇阻力時即停止進線，再次將栓線與頸外動脈共同結扎以固定栓線，松開頸總動脈上的動脈夾，縫合切口。此時封閉了大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)開口，阻斷了MCA的血流，制成MCAO模型。動物在手術中及手術后注意保溫。模型成功的標志為，動物清醒后出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱和行走時的追尾癥。

1.3實驗設計與分組大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為假手術組(Sham)、空白脂質體對照組(Vehicle)、13-MTD 40、80、120 mg·kg-1組(M40、M80、M120)。按缺血時間分為6、12、24 h組，即Sham-6、12、24 h組，Veh-6、12、24 h組，M40-6、12、24 h組，M80-6、12、24 h組，M120-6、12、24 h組，每組5只。Sham組除不插入線栓，其它相同。插入栓線前30 min分別尾靜脈注射脂質體包裹的13-MTD 40、80、120 mg·kg-1，Vehicle組給予等體積空白脂質體。各組大鼠均于相應缺血時間處死取材。

1.4神經(jīng)功能缺失評分參照Longa等[6]建立的神經(jīng)功能缺失評分標準，判斷模型是否成功。0分：無明顯神經(jīng)缺損癥狀，活動正常；1分：垂直提起時不能完全伸展對側前肢(輕度局灶性神經(jīng)功能缺損)；2分：行走時身體向偏癱側轉圈(中度局灶性神經(jīng)功能缺損)；3分：行走時向偏癱側傾倒(重度局灶性神經(jīng)功能缺損)；4分：不能自發(fā)行走或有意識障礙。缺血術后評1～3分者為手術成功的標志，手術中出血過多的動物棄去。

1.5腦梗死體積測定于相應的缺血時間迅速斷頭取腦，將腦組織置于生理鹽水冰盤上去除嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切片，每片厚約2 mm。切4刀，成5片。第1刀在腦前極與視交叉連線中點處；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄與葉尾極之間。迅速將腦片置2% TTC磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中避光染色，37 ℃溫孵30 min，其間每隔7～8 min翻動1次。溫孵完畢后，將腦片置10%福爾馬林中避光保存過夜。將固定后的染色結果拍照輸入計算機，利用AutoCAD圖像處理軟件求出梗死區(qū)域(白色)占大腦總體積的百分比(梗死灶體積不包括其周邊的的缺血半暗帶)，以此作為統(tǒng)計參數(shù)。

1.6腦水腫測定

1.6.1AutoCAD軟件測定腦水腫程度 于相應缺血時間，處死大鼠，迅速取出腦組織，切成等厚度的5片腦冠狀切片拍照后輸入計算機，利用圖像處理軟件AutoCAD，計算損傷側腦水腫程度：腦水腫=(損傷側腦半球體積-非損傷側腦半球體積)/非損傷側腦半球體積×100%[7]。

1.6.2腦干濕重測定腦含水量 于相應缺血時間，處死大鼠，迅速取出腦組織，切成等厚度的5片，準確稱量濕重后，將腦片放入烤箱內(nèi)110 ℃烤24 h，將腦片烤至恒重，取出稱量腦片干重。公式：腦水腫=(濕重-干重)/ 濕重×100%[7]。

1.7腦組織EB含量測定BBB通透性EB是一種常用的腦血管通透性指示劑，正常情況下EB與血清白蛋白結合而不能通過BBB。BBB受損時，EB-白蛋白可通過內(nèi)皮細胞的吞飲作用或經(jīng)細胞間隙，從血管內(nèi)進入腦組織。因此，通過計算腦組織EB的含量可以了解BBB的損傷程度。本實驗觀察MCAO各缺血時間點，各組大鼠腦組織EB的滲出情況，并計算其含量。于處死時間點，以10%水合氯醛半量麻醉動物后將線栓取出，從尾靜脈注射2% EB 2 mL·kg-1，幾秒鐘后，大鼠眼球結膜、四肢等處顯示藍色，表示注入成功。用生理鹽水250 mL從左心室灌注沖洗直至流出清亮液體，迅速斷頭取腦，在電子分析天平上稱濕重，損傷側置于裝有3 mL甲酰胺的勻漿器進行勻漿，54 ℃水浴孵育24 h后，3 000 r·min-1離心30 min，取200 μL上清置于96孔板，用酶標儀(λ=630 nm)測定各組的光密度值。根據(jù)標準曲線，計算出EB含量，依據(jù)所測得濃度計算出BBB對EB的通透率，以每克濕重腦組織內(nèi)所含EB的量(mg·kg-1)來表示。

1.8RT-PCR檢測腦組織AQP4mRNA表達取凍存于-80 ℃冰箱的各組腦組織，取腦皮層處100 mg組織液氮研磨，TRIzol法提取總 RNA，TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit逆轉錄合成cDNA。AQP4引物：256 bp,上游引物：5′-AGAACCAAGGCGTAAACCG-3′,下游引物：5′-TCCCTGGAAATGACTGAGAAA-3′;β-actin：698 bp，上游引物：5′-ACCTCCAACACCCCAGCCATG-3′，下游引物：5′-CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG-3′。取1 μL cDNA 進行 PCR 反應， 反應條件: 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28個循環(huán); 循環(huán)后均72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠電泳分析。電泳后在紫外燈下拍攝照片，用圖像處理軟件 Phoretix 1D分析目標條帶的灰度值。

1.9免疫組化檢測腦組織AQP4蛋白表達腦組織常規(guī)制備石蠟切片，58 ℃～60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復，3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗，正常山羊血清封閉10 min，一抗4 ℃過夜，PBS沖洗，加入二抗，37 ℃孵育10 min，PBS沖洗，加入SP復合物孵育10 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。使用同等對比度和曝光時間，在40×10倍普通顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.113-MTD對大鼠腦缺血后神經(jīng)功能的影響各組大鼠于腦缺血6、12、24 h時分別處死，并進行神經(jīng)功能缺失評分比較。如Fig 1所示，Sham組評0分，不同缺血時間組均有不同程度的神經(jīng)功能缺失癥狀，表現(xiàn)為右側眼瞼下垂，提尾懸空時左前肢內(nèi)收及軀干向左側扭轉，運動時出現(xiàn)向左側轉圈式行走為追尾征，神經(jīng)功能缺失嚴重時向左側傾倒，各缺血時段神經(jīng)功能評分有明顯差異(P<0.05)；與Vehicle組比較，13-MTD 40、80、120 mg·kg-1均可降低各缺血時段的神經(jīng)功能缺失評分(P<0.05)，且存在劑量依賴性(P<0.05)，以M80組改善最為明顯(P<0.05)。

Fig 1 Effect of 13-MTD on neurological deficit score in different groups after 6, 12 and 24 h MCAO in rats n=6)

#P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

2.213-MTD對大鼠腦缺血后腦梗死面積的影響如Fig 2所示，各缺血時間Sham組切片經(jīng)2% TTC染色后腦片全紅，色澤均勻；Vehicle組、缺血6 h損傷側腦組織尚可色澤度，整體完整，切片經(jīng)2% TTC染色后，缺血側腦片可見皮層部分有白色梗死灶，缺血12 h組白色梗死灶明顯，累及整個缺血側的大腦皮層，缺血24 h組白色梗死灶最為明顯，可累及到整個缺血側腦半球，并伴有輕度的糜爛；13-MTD 40、80、120 mg·kg-1組損傷側腦組織外觀均有所改善，白色梗死灶范圍均有所減少(P<0.05)，尤其以M80組治療效果最好(P<0.05)，各劑量組間存在劑量依賴性(P<0.05)。

2.313-MTD對大鼠腦缺血后腦水腫的影響

2.3.113-MTD對大鼠腦缺血后腦組織體積的影響 如Fig 3所示，各缺血時間Sham組大腦體積均勻；Vehicle組兩側腦組織體積不均等，缺血側腦組織體積稍大，與Sham組比較水腫明顯(P<0.05)；與Vehicle組相比， M40、M80、M120組腦組織水腫減輕(P<0.05)，以M80組效果最好(P<0.05)，各劑量組之間差異有顯著性(P<0.05)。

2.3.213-MTD對大鼠腦缺血腦組織含水量的影響 如Fig 4所示，與Sham組比較，各缺血時間Vehicle組腦組織含水量明顯增加(P<0.05)。與Vehicle組相比，M40、M80、M120組腦組織含水量均明顯下降(P<0.05)，并有量效差異，以M80組效果最好(P<0.05)。

2.413-MTD對大鼠腦缺血后BBB通透性的影響如Fig 5所示，與Sham組比較，各缺血時間Vehicle組可見明顯的藍色區(qū)域(P<0.01)。與Vehicle相比，M40、M80、M120組損傷腦EB滲出明顯減少(P<0.05)，以M80組效果最好，并有量效差異(P<0.05)。

2.513-MTD對大鼠腦缺血后AQP4表達的影響Fig 6的RT-PCR結果顯示，腦缺血12 h后，Sham組有極少量的AQP4 mRNA表達，Vehicle組腦組織

Fig 2 Comparison effect of 13-MTD on infarct size in different groups after MCAO 6, 12 and 24 h in rats n=6)

#P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

Fig 3 Effect of 13-MTD on cerebral edema in different groups caused by cerebral ischemia after MCAO 6, 12 and 24 h in rats n=6)

#P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

AQP4 mRNA表達水平升高(P<0.05)，M40、M80組均可使腦組織AQP4 mRNA表達降低(P<0.05)，各劑量之間差異有顯著性(P<0.05)，以M80組效果最好。

Fig 7的免疫組化結果顯示，腦內(nèi)AQP4蛋白表達呈陽性的細胞，胞膜上呈均勻分布的棕黃色顆粒。

Fig 4 Effect of 13-MTD on dry and wet weight in different groups caused by cerebral ischemia after MCAO 6, 12 and 24 h in rats n=5)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsvehicle;△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

AQP4蛋白主要表達于星形膠質細胞(astroglia，AST)胞膜上。Sham組有少量AQP4表達；Veh-6、12、24 h組AQP4表達升高；M80-6、12、24 h組AQP4蛋白表達下降。

3 討論

腦缺血后腦水腫的發(fā)生主要涉及兩個類型：細胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫。細胞毒性腦水腫產(chǎn)生于腦缺氧或者是水中毒，腦細胞缺氧后能量代謝發(fā)生障礙，故不能維持細胞內(nèi)外離子平衡，使水和離子進入細胞而產(chǎn)生腦水腫。細胞膜Na+的主動遷移過程依賴于Na+，K+-ATP酶(鈉泵)，對細胞容量起到維持作用，任何影響三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)代謝的化合物都會導致鈉泵的調(diào)節(jié)障礙，使Na+和水內(nèi)流，細胞發(fā)生腫脹[8]。Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡也是細胞毒性腦水腫的重要原因，亦可使細胞腫脹和死亡，Ca2+濃度升高可激活磷脂酶類，促進膜磷脂的分解，使細胞膜及細胞器膜結構受損[9]。血管源性腦水腫主要是BBB受損，導致水分子由血管內(nèi)向細胞外間隙移動，與血管通透性增高有關，水腫液為富含血漿蛋白的血漿濾液。其在白質是細胞外間隙擴大，在灰質則是細胞容積增大，細胞組分中變化最突出的是星形膠質細胞(AST),AST有明顯的胞飲現(xiàn)象。過去認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中信息的整合與傳遞是由神經(jīng)元承擔的，膠質細胞只是起到被動的輔助角色，但近來研究發(fā)現(xiàn)，AST在神經(jīng)系統(tǒng)中不僅是支持、提供營養(yǎng)及代謝等作用，其在神經(jīng)元的保護、BBB的形成、疼痛機制的調(diào)節(jié)過程中也發(fā)揮著積極作用，并參與免疫功能和神經(jīng)干細胞功能[10]。腦缺血發(fā)生早期，缺血區(qū)域毛細血管內(nèi)皮細胞和周圍的AST、神經(jīng)元開始腫脹，隨著缺血時間延長，AST上的AQP4大量表達，使AST持續(xù)腫脹，并引起B(yǎng)BB的破壞和毛細血管通透性的增加[11-12]。腦缺血后腦水腫發(fā)生時，MAPK信號通路激活能夠誘導AQP4表達[13]。研究發(fā)現(xiàn)，13-MTD可作為細胞膜成分嵌入膜脂質結構中，通過調(diào)節(jié)膜的組成而抑制MAPK信號激活[14]。

Fig 5 Effect of 13-MTD on EB in different groups caused by cerebral ischemia after MCAO 6, 12 and 24 h in rats n=6)

*P<0.05vssham; #P<0.05vsvehicle；△P<0.05vsM40;▲P<0.05vsM120

Fig 6 Change of ratio of AQP4/β-actin mRNA in different groups after MCAO 12h in rats n=6)

*P<0.001vssham;#P<0.01vsvehicle;△P<0.01vsM40

Fig 7 Comparison of expression of AQP4 protein in cerebral cortex detected by immunohistochemistry after MCAO 6, 12 and 24 h in rats (×400)

A : Sham-6 h; B: Veh-6 h; C: M80-6 h; D: Sham-12 h; E: Veh-12 h; F: M80-12 h; G: Sham-24 h; H: Veh-24 h; I: M80-24 h.

本實驗采用MCAO模型復制大鼠局灶性腦缺血6、12、24 h，證實13-MTD 40、80、120 mg·kg-1尾靜脈給藥可明顯減輕各時段MCAO后的腦損傷，以腦缺血12 h以內(nèi)的保護作用最好，各時段均以M80組改善更好，13-MTD能夠抑制大鼠腦缺血后腦水腫的形成。同時我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，13-MTD的保護作用與腦內(nèi)AQP4表達相關。其機制可能與13-MTD抑制MAPK信號激活，進而下調(diào)腦內(nèi)AST中AQP4基因和蛋白表達，改善細胞性腦水腫有關。

(致謝:感謝廈門大學藥學院、實驗動物中心和附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供的實驗條件和技術支持!)