新型SMO抑制劑SI-4650對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞增殖、凋亡和自噬能力的影響

周 游，孫麗丹，楊建林，秦 宇，曹春雨，王艷林

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002)

天然多胺(polyamine, PA)包括腐胺(putrescine, Put)、精脒(spermidine, Spd)和精胺(spermine, Spm)，是一類在真核細(xì)胞中普遍存在的、帶高密度正電荷的有機(jī)小分子[1]，可通過靜電作用力與細(xì)胞中DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂等帶負(fù)電荷的生物大分子產(chǎn)生相互作用，參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、細(xì)胞應(yīng)激等重要的生理過程[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)多胺水平升高能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而多胺含量降低則能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，多胺代謝途徑因此逐漸成為腫瘤防治和抗癌藥物設(shè)計(jì)的新靶標(biāo)[4-5]。

多種酶和蛋白因子參與了細(xì)胞內(nèi)多胺代謝的調(diào)控，其中精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)在多胺分解代謝中發(fā)揮重要作用。該酶直接以Spm為底物，將其氧化為Spd，同時(shí)生成3-氨基丙醛和H2O2[6]。研究發(fā)現(xiàn)，SMO表達(dá)異常導(dǎo)致的多胺代謝紊亂與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]，提示特異性靶向SMO的小分子抑制劑在相關(guān)疾病的防治中具有重要潛在應(yīng)用價(jià)值。由于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SMO小分子抑制劑的研究報(bào)道不多，這在很大程度上限制了SMO作為抗腫瘤分子靶點(diǎn)的基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究。本研究在前期工作中，運(yùn)用基于藥效團(tuán)的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和高通量虛擬篩選技術(shù)，結(jié)合分子和細(xì)胞水平上的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，獲得了一種新型SMO小分子抑制劑SI-4650(SMO inhibitor-4650，其分子結(jié)構(gòu)見Fig 1)，并發(fā)現(xiàn)該抑制劑對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞具有明顯抑制活性。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)SI-4650的抑瘤譜和對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，本研究分析了SI-4650對(duì)人膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞多胺代謝、增殖、遷移、凋亡和自噬的影響，為SI-4650在腫瘤防治中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究支撐。

Fig 1 Molecular structure of SI-4650

1 材料

1.1細(xì)胞株人膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)培養(yǎng)物典藏中心(武漢)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2試劑SI-4650(荷蘭Specs生物特殊化合物公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO, 美國(guó)Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗(天津?yàn)笊?；BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏顯影液(美國(guó)Thermo Scientific公司)；RIPA蛋白裂解液(武漢Servicebio公司)；LC3-Ⅰ/Ⅱ抗體、P62抗體、Beclin-1抗體、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase, PARP)抗體，均購(gòu)自美國(guó)CST公司；Bax抗體、Bcl-2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；β-actin抗體(北京科美博瑞)；pEGFP-LC3質(zhì)粒(美國(guó)Add Gene公司)；FITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)。

1.3儀器細(xì)胞超凈臺(tái)(上海新苗)；MCD175型恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、-80 ℃低溫冷凍冰箱(日本SANYO公司)；5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)； Waters e2695高效液相色譜分析儀(美國(guó)Waters公司)；FACSVerse流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)； A1+激光共聚焦顯微鏡、TE2000-S熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；Sirius化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(德國(guó)Berthold公司)；ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光成像顯影儀(上海勤翔)。

2 方法

2.1SI-4650的配制稱取SI-4650干粉溶解于DMSO中，配制成濃度為100 mmol·L-1的藥物儲(chǔ)存液，于-20 ℃低溫保存。使用前，用DMEM完全培養(yǎng)基將藥物儲(chǔ)存液稀釋至所需濃度。

2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG細(xì)胞懸液(5×106·L-1)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL(1.0×103個(gè)/孔)。置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h后，換用含不同濃度SI-4650的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)藥物濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入MTT試劑200 μL(終濃度0.2 g·L-1)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄MTT試劑，每孔加入150 μL DMSO充分溶解沉淀，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度值(A)。藥物對(duì)U87MG細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白組A值)]×100%。

2.3化學(xué)發(fā)光法分析SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞內(nèi)SMO、乙酰多胺氧化酶(N1-acetylpolyamineoxidase,APAO)酶活性的影響向用不同濃度SI-4650處理48 h后和對(duì)照U87MG細(xì)胞中，加入0.083 mol·L-1甘氨酸緩沖液(pH 8.0)200 μL，-80 ℃條件低溫凍融法裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，并用BCA法測(cè)定其總蛋白含量。各樣本取相同質(zhì)量的總蛋白液，根據(jù)參考文獻(xiàn)配制酶反應(yīng)體系[8]，以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)上清液中SMO和APAO的酶活性。

2.4HPLC法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多胺含量收集用不同濃度SI-4650處理48 h后和對(duì)照U87MG細(xì)胞，加入800 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min后，收集上清液至新的4 mL EP管中。BCA法測(cè)定上清中的蛋白濃度后，取總蛋白含量相同的細(xì)胞裂解液，用ddH2O補(bǔ)足體積至800 μL。加入1 mmol·L-1DAH 20 μL(內(nèi)標(biāo)分子)、2 mol·L-1NaOH 500 μL、苯甲酰氯10 μL，渦旋振蕩30 s，40 ℃水浴20 min后，加入2 mL飽和NaCl溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)液用2 mL乙醚顛倒混勻萃取，靜置分層后，留取上層乙醚液，重復(fù)萃取3次，合并上層萃取乙醚液，通風(fēng)櫥中揮發(fā)至干。用1 mL甲醇溶解沉淀后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶中，上Waters-e2695高效液相色譜分析儀進(jìn)行HPLC分析。HPLC的分析條件：Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)為固定相，乙腈-水(40 ∶60)為流動(dòng)相，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30 ℃。

2.5Transwell法分析細(xì)胞遷移能力收集用不同濃度SI-4650處理48 h后和對(duì)照U87MG細(xì)胞，并用含0.2% BSA的DMEM培養(yǎng)基重懸(2.5×108·L-1)。向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基(每孔800 μL)，將Transwell小室放入加有上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，并分別向小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，輕輕吸棄小室內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基，用1×PBS潤(rùn)洗小室3次，后用4%多聚甲醛固定小室30 min。用1×PBS潤(rùn)洗小室3次，再以結(jié)晶紫溶液染色15 min，再次用1×PBS潤(rùn)洗小室3次后，以濕棉簽拭去小室內(nèi)側(cè)面的細(xì)胞，將小室放在滴有1×PBS的載玻片上，于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)觀察視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期收集用不同濃度SI-4650分別處理24、48 h后及對(duì)照U87MG細(xì)胞，室溫1 000 r·min-1離心3 min后，棄上清。用1.5 mL預(yù)冷75%乙醇(1×PBS配制)重懸細(xì)胞，4 ℃固定過夜。室溫1 000 r·min-1離心5 min后，棄上清，加1.5 mL 1×PBS洗滌細(xì)胞，室溫1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用500 μL 1×Binding buffer(PBS配制，含50 μg·L-1RNase和0.1% TritonX-100)重懸細(xì)胞后，加0.5 g·L-1碘化丙啶(propidium iodide, PI)20 μL，37 ℃水浴避光條件下染色30 min后，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)將細(xì)胞懸液過濾于流式分析試管中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集用不同濃度SI-4650處理48 h后和對(duì)照U87MG細(xì)胞，室溫1 000 r·min-1離心3 min后，棄上清。參照FITC-Annexin V檢測(cè)試劑盒說明書，用100 μL 1×Binding buffer重懸細(xì)胞，加5 μL FITC-Annexin V和5 μL PI后混勻，25 ℃避光孵育15 min，再以400 μL 1×Binding buffer重懸混勻后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.8激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬小體形成將U87MG細(xì)胞懸液(5×107·L-1)接種于Confocal專用玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿接種3 mL(1.5×105個(gè)細(xì)胞/皿)。繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約80%時(shí)，根據(jù)Thermo TurboFect轉(zhuǎn)染試劑標(biāo)準(zhǔn)說明書，用2 μg pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，換用含不同濃度SI-4650的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察外源性重組綠色熒光蛋白GFP-LC3的亞細(xì)胞定位，分析U87MG細(xì)胞中自噬小體的形成情況。

2.9Westernblot檢測(cè)細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)收集用不同濃度SI-4650處理48 h后和對(duì)照U87MG細(xì)胞，加100 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中。BCA法測(cè)定上清中的總蛋白濃度，取含60 μg總蛋白的上清液，加1/4體積5×上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)至用5%脫脂牛奶(TBST配制)PVDF膜，室溫封閉2 h后，以TBST洗膜10 min×3次；加對(duì)應(yīng)一抗于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次；再用對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并記錄結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1SI-4650抑制U87MG細(xì)胞增殖用SI-4650(0、37.5、70、150、300、600 μmol·L-1)分別處理U87MG細(xì)胞24、48、72 h后，MTT法分析藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。Fig 2結(jié)果顯示，SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，抑制效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加而增強(qiáng)。利用GraphPad Prism7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在處理48 h的條件下，SI-4650作用于U87MG細(xì)胞的IC50值為(303.475±27.94)μmol·L-1。依據(jù)上述結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用終濃度分別為150、300 μmol·L-1的SI-4650處理的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以0 μmol·L-1處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。

Fig 2 SI-4650 inhibited proliferation of U87MG

U87MG cells were treated with SI-4650( 0,37.5, 70, 150, 300, 600 μmol·L-1) for 24, 48 and 72 h, and then the inhibitory rate of cell proliferation was detected by MTT assay.*P<0.05,**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1).

3.2SI-4650抑制U87MG細(xì)胞內(nèi)SMO和APAO的酶活性用150、300 μmol·L-1SI-4650分別處理U87MG細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞并制備細(xì)胞裂解液，每樣本取總蛋白質(zhì)量為18.65 μg的裂解液，以化學(xué)發(fā)光法分析SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞中SMO和APAO酶活性的影響，酶活性以單位總蛋白質(zhì)量(mg)、單位時(shí)間內(nèi)(s)內(nèi)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)表示。如Fig 3所示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)SI-4650處理后的U87MG細(xì)胞中SMO和APAO的酶活性均明顯下降。

3.3SI-4650影響U87MG細(xì)胞內(nèi)多胺的含量用150、300 μmol·L-1SI-4650分別處理U87MG細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞并制備細(xì)胞裂解液，以HPLC法分析SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞內(nèi)多胺含量的影響。如Fig 4所示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)SI-4650處理的U87MG細(xì)胞中，Put和Spd含量隨藥物濃度增加而明顯下降，Spm含量?jī)H在藥物濃度為150 μmol·L-1時(shí)明顯下降，細(xì)胞總多胺含量在兩種藥物濃度作用下均明顯降低。

Fig 3 Effect of SI-4650 on enzyme activity ofSMO and APAO in U87MG

*P<0.05,**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

Fig 4 Effect of SI-4650 on polyamine

**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

3.4SI-4650抑制U87MG細(xì)胞的遷移能力分別用150、300 μmol·L-1SI-4650處理 U87MG細(xì)胞48 h后，以Transwell法分析SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞遷移能力的影響。如Fig 5所示，SI-4650可明顯抑制U87MG細(xì)胞的遷移能力，且抑制能力隨藥物濃度增加而增強(qiáng)。

3.5SI-4650影響U87MG細(xì)胞的細(xì)胞周期用150、300 μmol·L-1SI-4650分別處理 U87MG細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞周期的影響。如Tab 1所示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，SI-4650處理U87MG細(xì)胞后可使G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增多，而G2期細(xì)胞數(shù)量減少，提示SI-4650可誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生G0/G1周期阻滯。

3.6SI-4650誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞凋亡用150、300 μmol·L-1SI-4650分別處理U87MG細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，并用PI/FITC-Annexin V雙染，流式細(xì)胞術(shù)分析SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡的影響。如Fig 6A所示，高劑量SI-4650可誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步的Western blot結(jié)果顯示(Fig 6B)，高濃度SI-4650能明顯上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，Bax/Bcl-2比值升高，且標(biāo)志性凋亡降解蛋白c-PARP水平明顯增加。值得注意的是，如Fig 6A所示，SI-4650處理后，U87MG細(xì)胞壞死的比例也明顯增加。提示除凋亡外，SI-4650還能導(dǎo)致U87MG細(xì)胞發(fā)生其它方式的死亡。

3.7SI-4650誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞自噬為分析SI-4650能否誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生自噬，首先用不同濃度的SI-4650處理轉(zhuǎn)染過pEGFP-LC3真核表達(dá)質(zhì)粒24 h后的U87MG細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察U87MG細(xì)胞中外源性表達(dá)的GFP-LC3融合蛋白的熒光強(qiáng)度及亞細(xì)胞定位。如Fig 7A所示，在未經(jīng)SI-4650處理的對(duì)照組細(xì)胞中，GFP熒光蛋白在細(xì)胞中呈彌散性均勻分布，而SI-4650處理后，細(xì)胞中GFP熒光蛋白呈斑點(diǎn)狀聚集。提示SI-4650能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，使得GFP-LC3融合蛋白大量向自噬小體發(fā)生轉(zhuǎn)移和聚集。

Tab 1 Effect of SI-4650 on cell cycle of U87MG

**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

進(jìn)一步Western blot法分析SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、P62、LC3-Ⅰ/Ⅱ表達(dá)水平的影響。Fig 7B結(jié)果顯示，SI-4650處理使自噬活化蛋白Beclin-1和自噬微管蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平隨藥物濃度的增高而大幅增加，而自噬底物蛋白P62的水平則減少。

4 討論

SMO作為一種多胺分解代謝的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平異常導(dǎo)致的多胺代謝紊亂與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[7]。SMO由此成為抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)和治療的潛在分子靶點(diǎn)。由于目前尚缺乏高效且特異性靶向SMO的小分子抑制劑，使該領(lǐng)域的基礎(chǔ)和臨床研究受到極大限制。SI-4650是本研究前期工作中設(shè)計(jì)和篩選出的一種SMO小分子抑制劑，為進(jìn)一步分析SI-4650的抑瘤譜和對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性，本研究在細(xì)胞水平上，探索了SI-4650對(duì)人膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和自噬的影響及其機(jī)制。

Fig 5 Effect of SI-4650 on migration ability of U87MG cells(100×) A: U87MG cells treated by 0 μmol·L-1 SI-4650; B: U87MG cells treated by 150 μmol·L-1 SI-4650; C: U87MG cells treated by 300 μmol·L-1 SI-4650; D: Quantized vs control(0 μmol·L-1)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SI-4650能有效抑制U87MG細(xì)胞增殖(48 h時(shí)IC50約為300 μmol·L-1)，并誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生G0/G1周期阻滯。由于SI-4650是以藥效團(tuán)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)和篩選的小分子SMO靶向抑制劑，本實(shí)驗(yàn)分析了該抑制劑對(duì)U87MG細(xì)胞中SMO活性的影響，結(jié)果表明，SI-4650能有效抑制U87MG細(xì)胞中SMO的酶活性。此外，該抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)的APAO也具有明顯抑制作用。APAO是參與多胺降解代謝的另一種胺氧化酶，它與SMO之間有較高程度的結(jié)構(gòu)相似性[6]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SI-4650能通過多靶點(diǎn)途徑干擾細(xì)胞內(nèi)的多胺代謝。

進(jìn)一步用HPLC法分析了SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞內(nèi)多胺含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SI-4650處理后，細(xì)胞內(nèi)總多胺含量下降，Spd(SMO催化反應(yīng)的產(chǎn)物)含量隨藥物濃度增加而明顯下降，這與預(yù)期結(jié)果相符合；但Spm(SMO催化反應(yīng)的底物)含量未見升高，在低濃度SI-4650(150 μmol·L-1)處理時(shí)還有明顯下降。產(chǎn)生該現(xiàn)象的可能原因是多胺降解代謝受阻后，Spm經(jīng)精瞇/精胺N1乙?；D(zhuǎn)移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase, SSAT)催化轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴＞泛螅ㄟ^U87MG細(xì)胞膜表面的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體[9-10]而排出至細(xì)胞外。

隨后我們分析了SI-4650對(duì)U87MG細(xì)胞遷移、凋亡和自噬的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SI-4650能有效抑制U87MG細(xì)胞的遷移能力，并誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬分別被稱為I型和II型程序性細(xì)胞死亡，二者之間雖然在死亡機(jī)制、細(xì)胞形態(tài)改變、死亡細(xì)胞清除方式等方面存在明顯差異，但這兩種死亡方式之間也存在相互影響和相互聯(lián)系的復(fù)雜關(guān)系。目前研究認(rèn)為，二者之間的關(guān)系主要有3種特征：相互促進(jìn)、相互拮抗和相互協(xié)調(diào)。在特定的情況下，兩者之間可以相互轉(zhuǎn)化，形成一種促進(jìn)細(xì)胞死亡的“雙保險(xiǎn)”機(jī)制[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照細(xì)胞，高濃度SI-4650(300 μmol·L-1)處理后的U87MG細(xì)胞與FITC-Annexin V結(jié)合的比率明顯升高，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)凋亡降解底物c-PARP水平大幅增高，提示SI-4650可明顯誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生凋亡。

除誘導(dǎo)凋亡外，本研究還發(fā)現(xiàn)SI-4650可有效誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。用SI-4650處理轉(zhuǎn)染有GFP-LC3融合基因的U87MG細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的GFP熒光信號(hào)由彌散狀向斑點(diǎn)聚集狀轉(zhuǎn)化，表明SI-4650處理促使GFP-LC3融合蛋白大量轉(zhuǎn)移聚集到了自噬小體上。LC3-Ⅱ是自噬體形成的特異性分子標(biāo)記物，它由LC3-Ⅰ在自噬發(fā)生過程中轉(zhuǎn)化而來，而P62是選擇性的自噬底物，它能結(jié)合到LC3-Ⅱ上，在自噬過程中被運(yùn)輸?shù)阶允尚◇w中降解[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，用SI-4650處理后，U87MG細(xì)胞中自噬激活相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)增多，但P62蛋白水平降低，這些結(jié)果提示SI-4650可明顯誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

Fig 6 Effect of SI-4650 on apoptosis of U87MG cells

Fig 7 Effect of SI-4650 on autophagy of U87MG cells

值得的注意的是，SI-4650本身是甲酰喹啉與一種三胺分子的共價(jià)綴合物，尚需進(jìn)一步探索的是，除抑制SMO活性外，該小分子抑制劑是否還能通過其它不依賴于SMO的途徑，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡。此外，SI-4650中的三胺部分與天然精脒結(jié)構(gòu)類似，它是否能扮演一種多胺類似物的角色，競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞內(nèi)天然多胺的代謝與功能，進(jìn)而發(fā)揮多重抗腫瘤效應(yīng)，這也需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中展開深入分析研究。

綜上所述，本研究證實(shí)SMO小分子抑制劑SI-4650可明顯干擾U87MG細(xì)胞內(nèi)的多胺代謝，有效降低多胺含量，可以抑制U87MG細(xì)胞的增殖和遷移能力，并誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬性死亡。本研究結(jié)果提示SI-4650在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。