Keap1-Nrf2信號(hào)通路在肝再生中的作用及相關(guān)藥物研究進(jìn)展

白慶云

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000)

肝再生是肝臟在化學(xué)損傷或者手術(shù)切除部分肝臟后，殘留肝細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞增殖由原來(lái)的基本不生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖偕L(zhǎng)狀態(tài)，以恢復(fù)在功能和解剖學(xué)上損失的組織[1]。目前，人類面對(duì)的最主要致命疾病之一就是肝硬化和重型肝炎等肝病，在我國(guó)肝臟疾病發(fā)病率越來(lái)越高，肝臟疾病或損傷遷延不愈最終會(huì)發(fā)展成為肝硬化，甚至肝癌。從全球來(lái)看，在終末期肝病發(fā)病率方面，我國(guó)是最高的國(guó)家，每年新增患者在600萬(wàn)例以上[2]。嚴(yán)重的肝損傷往往需要進(jìn)行肝臟移植，而這往往會(huì)加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如果能通過(guò)藥物等手段使肝損傷后的肝臟得以修復(fù)，或者能促進(jìn)肝部分切除術(shù)和肝臟移植后的肝臟再生，都是非常有意義的。因此，深入了解肝再生過(guò)程中的特點(diǎn)、規(guī)律和機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)，是目前一個(gè)非常重要的課題。本文就肝再生的影響因素、過(guò)程和機(jī)制、核因子E2相關(guān)因子2 (NF-E2-related factor 2, Nrf2)在肝再生中的作用以及影響肝再生的藥物進(jìn)行綜述。

1 肝再生

肝臟本身具有非常強(qiáng)的再生功能，肝部分切除后，剩余肝臟的肝細(xì)胞在分裂與增殖方面都特別活躍，短期內(nèi)便可使肝臟恢復(fù)到原來(lái)的尺寸。以進(jìn)行了肝切除的大鼠為例，切除其肝的90%之后，僅兩個(gè)星期的時(shí)間，肝臟的重量就可以恢復(fù)到原來(lái)的水平，但是在這以后結(jié)構(gòu)的恢復(fù)需要很長(zhǎng)的時(shí)間，只有待新的肝小葉結(jié)構(gòu)成形，原有功能才會(huì)恢復(fù)[3]。除了肝切除術(shù)后會(huì)出現(xiàn)肝再生，藥源性肝損傷后也會(huì)出現(xiàn)肝臟再生，如大量長(zhǎng)期使用對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)后，肝臟會(huì)在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19的促進(jìn)下再生[4]。

肝再生分為3個(gè)主要過(guò)程[5]：(1)啟動(dòng)階段：肝再生啟動(dòng)階段是指原來(lái)處于靜止?fàn)顟B(tài)的肝細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。在此階段中，涉及到的細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細(xì)胞介素6 (interleukin 6，IL-6)。機(jī)體切除肝臟之后，在1 h之內(nèi)機(jī)體的TNF-α含量明顯升高，因?yàn)門NF-α在肝再生的早期階段和對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合之后，會(huì)產(chǎn)生一種特殊的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，激活轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)。IL-6在急性反應(yīng)后，與受體一起激活酪氨酸激酶，隨后信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)被激活，表達(dá)增加，同時(shí)激活其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，然后在生長(zhǎng)因子的促進(jìn)下，肝再生過(guò)程被啟動(dòng)。(2)增殖階段：肝再生增殖階段主要指肝細(xì)胞在促有絲分裂原的作用下，進(jìn)行細(xì)胞分裂和增殖的過(guò)程。此階段是整個(gè)肝臟再生的重要階段，涉及到的最重要的細(xì)胞因子主要為表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)。(3)終止階段：當(dāng)細(xì)胞增殖完成后, 肝臟在組織學(xué)上的結(jié)構(gòu)得以恢復(fù)，肝再生便進(jìn)入終止階段。參與此階段的主要是卵圓細(xì)胞，它在肝臟細(xì)胞增殖過(guò)程中數(shù)目發(fā)生明顯變化，推測(cè)它可能促進(jìn)肝細(xì)胞的再生，促進(jìn)了肝臟的修復(fù)。

2 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的調(diào)控因子，為含有624個(gè)氨基酸的多肽，是Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)合蛋白。Nrf2是含有6個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域Neh的氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子，是抗氧化反應(yīng)元件(antioxident response element, ARE)在靶基因的啟動(dòng)子[6]。通常情況下，Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中并與Keapl結(jié)合，起到將Nrf2固定在胞質(zhì)中的作用，同時(shí)Keapl與泛素化連接酶結(jié)合，對(duì)Nrf2的泛素化與降解產(chǎn)生促進(jìn)作用。在接觸了一些外界刺激后，如經(jīng)過(guò)活性氧(reactive oxygen species, ROS)、活性氮、脂質(zhì)醛和15-脫氧-D-內(nèi)源性前列腺素的刺激，Keap1和Nrf2會(huì)分離開來(lái)。一旦Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，在Maf蛋白的作用下，Nrf2同ARE結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，如抗氧化蛋白、Ⅱ相解毒酶、蛋白酶體Π分子伴侶等，從而發(fā)揮抵御內(nèi)外界的有害刺激的作用[7]，見Fig 1。

Fig 1 Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway

在生理狀態(tài)下，Nrf2參與調(diào)節(jié)氧化還原平衡、細(xì)胞的增殖、凋亡過(guò)程、炎癥過(guò)程、物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)的折疊等。眾所周知，Nrf2是機(jī)體氧化還原反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)器，它可以對(duì)多種抗氧化基因的表達(dá)產(chǎn)生促進(jìn)作用，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、醌氧化還原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate cysteine ligase catalytic, GCLC)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase modifier subunit, GCLM)等[8]。Nrf2能降低藥物對(duì)不同器官的毒性，如藥物對(duì)腦、肺、皮膚、肝臟、腎臟的毒性，同時(shí)對(duì)某些疾病具有改善作用，Mao等[9]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠由于缺乏Nrf2導(dǎo)致神經(jīng)缺損和神經(jīng)細(xì)胞凋亡、創(chuàng)傷性腦損傷、運(yùn)動(dòng)功能障礙和脊髓損傷。此外，Keap-Nrf2-ARE信號(hào)通路還與衰老、細(xì)胞損傷、生育等多方面關(guān)系密切。

3 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路與肝再生

Nrf2-ARE信號(hào)通路通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)抗肝臟的氧化損傷，如調(diào)節(jié)肝臟的代謝、解毒和促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。大量研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖而促進(jìn)肝的再生。Zou等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出Nrf2在肝再生中類似于一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)器，這個(gè)觀點(diǎn)在肝臟部分切除手術(shù)中的小鼠上得以證實(shí)，他們發(fā)現(xiàn)Nrf2的缺乏不影響進(jìn)入細(xì)胞周期的肝細(xì)胞數(shù)目，只是使細(xì)胞有絲分裂受到抑制。作者還證明在肝再生中，Nrf2通過(guò)細(xì)胞周期素A2(Cyclin A2)和Wee1/Cdc2/Cyclin Bl途徑，來(lái)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的增殖。另一方面，胡敏[11]也進(jìn)行了有關(guān)Keap1-Nrf2在肝再生中調(diào)控氧化還原循環(huán)和對(duì)肝細(xì)胞周期影響的研究，該研究將Keap1+/+和Keap1+/-小鼠，以及Nrf2+/+與Nrf2-/-小鼠切除其2/3肝臟，術(shù)后在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞周期蛋白、肝細(xì)胞增殖、肝氧化還原狀態(tài)以及有絲分裂信號(hào)分子的功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，Keap1基因敲除能夠延遲增殖的肝細(xì)胞進(jìn)入S期，擾亂有絲分裂的節(jié)律性，但對(duì)肝細(xì)胞整體的再生過(guò)程影響不大，而Nrf2基因敲除延緩了小鼠的肝再生過(guò)程。

APAP是引起藥物性肝損傷的主要原因之一。研究人員通過(guò)給小鼠注射APAP 400 mg·kg-1后發(fā)現(xiàn)，在12 h內(nèi)小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肝毒性，而肝臟功能的恢復(fù)卻要在24 h之后。注射APAP后，Nrf2的表達(dá)量和在細(xì)胞核中的積累量都有增加，24 h后，Nrf2下游基因NQO1、GCLM和HO-1的表達(dá)也增加。此外，給予APAP注射后，p53及其下游基因p21表達(dá)快速增加，48 h后，細(xì)胞周期依賴性激酶4 (cyclin dependent kinase 4, CDK4)、細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)、肝再生增強(qiáng)因子、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的水平均明顯提高，提示啟動(dòng)組織修復(fù)與肝細(xì)胞增殖。此研究說(shuō)明，在APAP發(fā)生損傷之后，Keap1-Nrf2-ARE通路調(diào)控肝再生是一個(gè)動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)過(guò)程[12]。同樣，Dayoub等[13]也證實(shí)了Nrf2通過(guò)誘導(dǎo)肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration, ALR)，促進(jìn)肝臟再生。但也有研究報(bào)道稱，Nrf2延遲了肝細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)肝細(xì)胞在肝再生中的凋亡[14]。

此外，還有一些關(guān)于Nrf2在肝再生、肝臟疾病和各種外界因素引起的肝損傷中作用的報(bào)道。Shin等[15]分析了Nrf2在病毒性、藥物性和化學(xué)性肝炎或者是一些肝臟疾病，如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝癌中的作用，發(fā)現(xiàn)Nrf2的缺失會(huì)使小鼠對(duì)各種應(yīng)激的抵抗性降低，而Nrf2的誘導(dǎo)劑可以用于致癌物質(zhì)的預(yù)防，說(shuō)明Nrf2在肝臟病理生理學(xué)中具有舉足輕重的作用。Wakabayashi等[16]通過(guò)對(duì)Keap1-或Nrf2-阻斷后小鼠的分析，發(fā)現(xiàn)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路和Notch1信號(hào)通路有關(guān)，而Notch1是一種細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)肝再生方面發(fā)揮重要作用。Buitrago-Molina等[17]報(bào)道稱，在p21缺陷的小鼠中，肝臟的再生和肝癌的發(fā)生被削弱，而且肝臟的損傷程度和p21的活性強(qiáng)度決定Nrf2對(duì)肝再生的影響。Beyer等[18]分析了Nrf2在細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中的調(diào)節(jié)作用，在Nrf2缺失的情況下，進(jìn)行了部分切除手術(shù)的肝臟的肝再生被延遲，這表明Nrf2可以激活急性或慢性疾病后肝臟的再生和修復(fù)。肝再生過(guò)程的分子機(jī)制以及Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)肝再生的調(diào)節(jié)機(jī)制見Fig 2。

Fig 2 Regulation of Keap1-Nrf2-ARE signaling

4 促進(jìn)肝再生藥物的研究

肝臟再生是一個(gè)很復(fù)雜的細(xì)胞增殖的過(guò)程，在實(shí)際的肝臟再生過(guò)程中，多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路參與到肝臟再生的調(diào)控中。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路在肝再生中具有重要的調(diào)控作用，參與肝再生的各個(gè)環(huán)節(jié)，因此，研究作用于此信號(hào)通路的藥物，對(duì)肝臟損傷或者手術(shù)切除后的肝修復(fù)和再生具有重要價(jià)值。

除上述天然藥物活性成分外，還有少數(shù)合成藥物也可以通過(guò)抗氧化促進(jìn)肝再生，如雙環(huán)醇為人工合成的抗病毒性肝炎的新藥。姚曉敏[23]研究發(fā)現(xiàn)，雙環(huán)醇可抑制肝臟部分切除大鼠肝臟和微粒體中MDA的含量，還能恢復(fù)肝臟SOD活性，阻止肝臟谷胱甘肽(glutathione, GSH)耗竭，通過(guò)抗氧化損傷來(lái)減輕ROS對(duì)肝細(xì)胞增殖的抑制作用，從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。Shimada等[24]研究發(fā)現(xiàn)，硫氫化鈉可通過(guò)直接和間接的抗氧化活性，改善肝臟缺血/再灌注損傷，經(jīng)硫氫化鈉處理后，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的比率明顯增高。該研究顯示，硫氫化鈉能增加Nrf2的核移位，上調(diào)HO-1的表達(dá)，并通過(guò)PDK-1/Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生。

5 結(jié)論及展望

肝臟是機(jī)體的一個(gè)重要的代謝器官，具有潛在再生能力，當(dāng)受到病理性的損傷或部分切除后，便會(huì)啟動(dòng)再生程序。肝臟損傷或被部分切除后，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路通過(guò)影響肝細(xì)胞的細(xì)胞周期和有絲分裂等方式，促進(jìn)肝臟的再生。肝再生的狀況決定性地影響肝臟組織解剖學(xué)上的重建和肝功能的修復(fù)，所以對(duì)于肝臟被部分切除、肝移植的患者或者嚴(yán)重的肝損傷來(lái)說(shuō)，通過(guò)藥物干預(yù)以促進(jìn)肝臟的修復(fù)和再生就顯得尤為重要。由于Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)肝再生的關(guān)鍵性，那么能夠激活此信號(hào)通路的藥物，就有可能成為促進(jìn)肝再生的潛在新藥，這可以為促肝再生藥物機(jī)制的研究和以后的新藥研發(fā)提供思路。通過(guò)上述文獻(xiàn)綜述可以看出，這方面的藥物研究多集中于天然產(chǎn)物，但為數(shù)不多，說(shuō)明相關(guān)的藥物研究有待加強(qiáng)。