以斑馬魚為疾病模型的小分子藥物篩選研究進(jìn)展?

趙呈天， 賈 碩， 張曉麗

(中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003)

斑馬魚(Daniorerio)是一種硬骨魚，原產(chǎn)于南亞，屬于輻鰭魚綱(Actinopterygii)，鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，短擔(dān)尼魚屬(Danio)。它是典型的亞熱帶淡水觀賞魚類，體表分布有藍(lán)色銀色相間的條紋，類似斑馬身上的條紋，故被稱為斑馬魚。斑馬魚體型纖細(xì)，性情溫和，容易飼養(yǎng)，對(duì)水質(zhì)要求不高且生長周期較短，3個(gè)月左右達(dá)到性成熟。繁殖周期通常在一周左右，一次產(chǎn)卵量可達(dá)幾百枚。卵子體外受精，體外發(fā)育，其胚體透明，胚胎發(fā)育同步且速度快，可以在不損傷胚胎的前提下清晰地觀察斑馬魚胚胎各器官的生長發(fā)育情況。

正因?yàn)槠渚邆渖鲜鲞@些特點(diǎn)，引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。近年來，以斑馬魚為模式動(dòng)物的科研工作發(fā)展迅速，斑馬魚全基因組測序的完成[1-2]極大加速了對(duì)其基因功能的深入研究，同時(shí)整胚原位雜交技術(shù)、以CRISPR/Cas9為代表的基因敲除技術(shù)[3]、以反義MO為代表的基因敲降技術(shù)[4]和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等都可很好的應(yīng)用于斑馬魚基因功能研究中。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚雖然在器官構(gòu)造和形態(tài)方面與人類不盡相同，但是在細(xì)胞和分子水平上與人類十分相似。有研究表明，大約70%的人類基因至少有一個(gè)明顯的斑馬魚直系同源物[2]，通過大規(guī)模誘變篩選，英國Wellcome Trust Sanger研究所已經(jīng)建立了超過3 000個(gè)與人類疾病相關(guān)的基因的突變品系[1]。這些結(jié)果表明，斑馬魚不僅是研究脊椎動(dòng)物發(fā)育過程的理想模型，也是模擬人類疾病的良好模型。

1 斑馬魚在小分子藥物篩選中具有非常大的優(yōu)勢

小分子化學(xué)藥物的篩選在近幾年的研究中發(fā)展迅速，多種方法被運(yùn)用到篩選當(dāng)中。首先是較傳統(tǒng)的體外篩選，包括細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外篩選等，這種篩選方法的缺點(diǎn)比較明顯。第一，一些特殊類型的細(xì)胞和大多數(shù)器官在體外無法培養(yǎng)或重建；第二，體外培養(yǎng)的細(xì)胞無法模擬體內(nèi)細(xì)胞外的微環(huán)境；第三，體外培養(yǎng)無法模擬疾病的發(fā)展過程。為了解決體外藥物篩選的缺陷，研究人員又采用無脊椎模式生物，其中果蠅和線蟲最具代表性。但是無脊椎動(dòng)物往往缺乏復(fù)雜的系統(tǒng)和器官，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)也與人類相去甚遠(yuǎn)，因此只能在一些特定的篩選中發(fā)揮作用。與傳統(tǒng)的體外細(xì)胞培養(yǎng)以及簡單的無脊椎動(dòng)物模型(如果蠅和秀麗隱桿線蟲)的小分子藥物篩選不同，斑馬魚提供了一個(gè)完整的用于藥物發(fā)現(xiàn)的活體脊椎動(dòng)物系統(tǒng)，兼之其強(qiáng)大的繁殖能力和低廉的飼養(yǎng)成本，使得體內(nèi)模型的生物學(xué)復(fù)雜性與高通量篩選的能力結(jié)合在一起(見圖1)。同時(shí)，因?yàn)樗幬镌隗w內(nèi)發(fā)揮作用，因此在評(píng)估藥物功能的同時(shí)還能兼顧藥物毒性。轉(zhuǎn)基因斑馬魚能夠通過熒光蛋白標(biāo)記特定的組織器官，因此僅通過熒光檢測就能初步判斷藥物效果，為藥物篩選帶來了很大的便利。

(首先通過交配獲取大量的轉(zhuǎn)基因或突變體品系胚胎，待發(fā)育至特定階段后進(jìn)行小分子藥物孵育處理，并在發(fā)育過程中分析胚胎的多種生物學(xué)性狀，如利用高通量設(shè)備檢測胚胎基因表達(dá)水平，形態(tài)發(fā)育及行為學(xué)檢驗(yàn)等，確定命中的小分子藥物。之后，再通過哺乳動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的藥理學(xué)檢驗(yàn)，最終獲得可用于生產(chǎn)銷售的新型藥物。The transgenic or mutant embryos are first incubated with small molecule drugs for a desired period of interest.Then,the treated embryos are analyzed with different methods,including phenotypic analysis,high-throughput detecting of gene expression level and/or behavioral tests to determine the potential hits.After that,further pharmacological tests can be conducted on mammalian models.If the compound is approved for safety and efficacy,clinical trials will be further conducted to determine whether it can be approved as a new drug.)

圖1 常用斑馬魚小分子藥物篩選流程Fig.1 Small molecule screening strategy for drug discovery using zebrafish model

續(xù)表1

疾病Diseases斑馬魚品系Zebrafish lines小分子藥物Small molecule drugs分子機(jī)制Molecular mechanisms參考文獻(xiàn)References肝細(xì)胞癌Hepatocellular carcinomaTg(fabp10a:pt-β-cat)SP600125、阿米替林(Amitriptyline)、帕羅西汀(Paroxetine)SP600125通過抑制JNK途徑抑制腫瘤發(fā)生,阿米替林和帕羅西汀可能通過抑制5-羥色胺途徑發(fā)揮作用。[22]乳腺癌Mammary cancerTg(cldnb:EGFP)大黃素(Emodin),SU6656,RBI抑制原癌基因Src途徑。[23]Tg(kdrl:EGFP)s843IT1t拮抗趨化因子受體CXCR4。[15]脂肪肝Hepatic adiposeinfiltrationWT依澤替米貝(Ezetimibe)和辛伐他汀(Simvastatin)具體機(jī)制不明。[27]糖尿病DiabetesTg(tp1:hmgb1-mCherry;pax6b:GFP)霉酚酸(MPA), 戒酒硫(DSF)霉酚酸通過抑制GTP的產(chǎn)生促進(jìn)β細(xì)胞的分化,戒酒硫通過抑制視黃酸信號(hào)誘導(dǎo)繼發(fā)性β細(xì)胞的分化。[28]Tg(ins:PhiYFP-2a-nfsB; sst2: tagRFP)小白菊內(nèi)酯(Parthenolide)和硫辛酸(Thioctic acid); 帕羅西汀(Paroxe-tine)和阿米替林(Amitriptyline)小白菊內(nèi)酯和硫辛酸抑制NF-κB通路增強(qiáng)了β細(xì)胞的分化,帕羅西汀和阿米替林則是通過5-羥色胺途徑增強(qiáng)β細(xì)胞的分化。[29]Tg(lfabp:GAL4-VP16;UAS: nfsB-mCherry)阿立西定(Alexidine)通過抑制PTEN樣線粒體磷酸酶PT-PMT1來降低血糖水平。[30]鐵代謝病Disorders of iron metabolismTg(ubi:Fpn-GFP); pgrmc1 morphants表雄醇(Epitiostanol)、孕酮(Proges-terone)和米非司酮(Mifepristone)增加鐵調(diào)素的生物合成來降低鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。[32]線粒體病MitochondriopathyWT普羅布考(Probucol)抑制mTORC1信號(hào),激活A(yù)MPK和PPAR通路信號(hào)。[35]Dravet 綜合征Dravet syndromescn1 mutants芬氟拉明(Fenfluramine)調(diào)節(jié)5-羥色胺信號(hào)通路[37]癲癇 Epilepsykcna1 morphants伏立諾他(Vorinostat)組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑[38]肌肉疾病Myopathiesher1、hes6 mutantsSB225002,XRP44XSB22502抑制斑馬魚中的趨化因子受體Cxcr2功能,XRP44X可以影響Ras-Elk信號(hào)傳導(dǎo)途徑,并抑制微管聚合。[39]骨質(zhì)疏松OsteoporosisWTRWJ-60475, 鹽酸左旋咪唑(Levami-sole HCL), 鹽酸四咪唑(Tetramisole HCL), 氰戊菊酯 (Fenvalerate), NSC-663284, BML-267酯(BML-267ester); BML-267, 潘它米丁(Pen-tamidine)。調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和BMP相關(guān)途徑。[40]

2 斑馬魚作為疾病模型在藥物篩選中的應(yīng)用

相對(duì)于其他脊椎動(dòng)物而言，斑馬魚具有低成本、短周期、便于高通量篩選等顯著優(yōu)勢，目前已經(jīng)被應(yīng)用于藥物篩選的多個(gè)方面(見表1)，下面介紹一下斑馬魚作為不同疾病模型的藥物篩選研究進(jìn)展。

2.1 循環(huán)系統(tǒng)疾病

心臟病是一種常見的循環(huán)系統(tǒng)疾病，大多無法徹底治愈且經(jīng)常復(fù)發(fā)，給患者和社會(huì)造成了很大負(fù)擔(dān)。研究表明，增強(qiáng)心肌細(xì)胞的增殖能力，使心臟具有再生潛能可能是一種有效的治療方式。最近，Magadum等篩選出一種誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖的小分子—carbacyclin，并利用斑馬魚、小鼠等研究表明該小分子可以通過激活PPARδ/ PDK1 / p308Akt /GSK3β/β-catenin通路促進(jìn)心肌細(xì)胞再生[5]。

在造血方面，雖然斑馬魚與人類造血的部位不盡相同，但在基因調(diào)控方面仍然保持著較高的同源性。2007年，Zon課題組報(bào)道了他們的研究成果：通過藥物篩選，他們發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)前列腺素E2(Prostaglandin E2)合成的化合物能夠增加造血干細(xì)胞的數(shù)量，并且前列腺素E2本身也能夠增加斑馬魚和小鼠中造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞(Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)的數(shù)量，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的體內(nèi)平衡[6]。后來的研究表明，前列腺素E2及其衍生物在促進(jìn)臍帶血細(xì)胞移植后造血干細(xì)胞增殖上也發(fā)揮重要作用[7-8]。2015年，Zon課題組通過構(gòu)建HSPCs特異的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，篩選出TGF-β受體抑制劑SB-431542以及石蒜堿(Lycorine)等促進(jìn)HSPCs增殖的小分子化合物[9]。同年，Li等使用斑馬魚全腎骨髓(Whole kidney marrow, WKM)移植的方法，將帶有熒光的斑馬魚全腎骨髓細(xì)胞移植入經(jīng)過亞致死劑量照射的casper突變體中，通過觀察熒光強(qiáng)度來確定藥物是否有效，經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)可以有效的增加植入骨髓細(xì)胞的數(shù)量[10-11]。這些研究都表明，斑馬魚作為疾病模型在循環(huán)系統(tǒng)的藥物篩選方面發(fā)揮了重要作用。

2.2 癌癥

癌癥是當(dāng)今社會(huì)人類健康的最大威脅之一，有關(guān)癌癥藥物的研發(fā)一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)。斑馬魚作為人類癌癥模型已廣泛的應(yīng)用于藥物篩選中，包括黑色素瘤[12]，白血病[13]，結(jié)腸癌[14]，乳腺癌[15]等。

黑色素瘤是一種皮膚癌，除了家族遺傳，基因突變以外，過度暴露于陽光和紫外線也是發(fā)病的主要原因，其中轉(zhuǎn)移性黑色素瘤有著較高的致死率[16]。White等利用轉(zhuǎn)基因Tg(mitf-BRAFV600E;p53-/-)品系構(gòu)建了黑色素瘤的斑馬魚動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)黑色素瘤形成過程中存在神經(jīng)嵴祖細(xì)胞分化異常的現(xiàn)象，而二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)抑制劑, 如來氟米特(Leflunomide),可以抑制神經(jīng)嵴發(fā)育和黑色素瘤的生長[17]?；谶@個(gè)發(fā)現(xiàn)，2016年，同課題組的Tan等將轉(zhuǎn)錄延長調(diào)節(jié)因子HEXIM1成功鑒定為黑色素瘤抑制因子[18]。Dang等采用了對(duì)成年斑馬魚口服灌胃技術(shù)，篩選抑制黑色素瘤生長的藥物，通過研究發(fā)現(xiàn)，使用BRAFV600E特異性抑制劑維羅非尼(Vemurafenib)以亞致死劑量給藥2周，可對(duì)約65%個(gè)體的腫瘤生長產(chǎn)生抑制效果[19]。最近，Kim等篩選出了一批能夠誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞增殖分化的微環(huán)境因子，其中內(nèi)皮素3(EDN3)及其合成酶ECE2能夠強(qiáng)烈的促進(jìn)黑色素瘤的轉(zhuǎn)移性生長，而CRISPR介導(dǎo)的EDN3和ECE2的失活能夠顯著增加患黑色素瘤動(dòng)物的存活率[20]，該結(jié)果表明微環(huán)境在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤分化中的重要功能，也為這一惡性腫瘤的治療提供了潛在靶點(diǎn)。

β-catenin是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)重要成員，編碼β-catenin的CTNNB1基因突變是肝細(xì)胞癌的主要特征之一[21]，Evason等利用Tg(fabp10a:pt-β-cat)轉(zhuǎn)基因斑馬魚，發(fā)現(xiàn)SP600125、阿米替林(Amitriptyline)和帕羅西汀(Paroxetine)能夠抑制β-catenin誘導(dǎo)的肝臟生長，其中阿米替林還在小鼠肝癌模型中有一定的治療作用[22]。

癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是癌癥發(fā)展過程中的重要一步，斑馬魚側(cè)線原基細(xì)胞在發(fā)育中的遷移過程可以部分模擬腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Gallardo等利用斑馬魚Tg(cldnb:EGFP)轉(zhuǎn)基因品系特異標(biāo)記側(cè)線原基細(xì)胞，篩選出了165種無明顯毒性且干擾側(cè)線原基遷移的小分子藥物，包括三種與神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移相關(guān)的Src信號(hào)通路抑制劑：大黃素(Emodin)，SU6656和RBI。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠中SU6656也具有抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[23]。

腫瘤異質(zhì)性(Tumor heterogeneity)[24]是癌癥治療的一大難題，即使是相同基因組相同克隆的腫瘤細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生對(duì)治療的不同反應(yīng)[25]，因此，對(duì)待不同的癌癥患者可能也要采取不同的治療方案。小鼠異種移植是體內(nèi)評(píng)估腫瘤異質(zhì)性的良好手段，但由于其生長所需時(shí)間及高額的成本，使得這種方法在臨床中并不實(shí)用。斑馬魚胚胎具有透明度高、生長周期短和飼養(yǎng)成本低的特點(diǎn)，利用斑馬魚研究人類腫瘤細(xì)胞異種移植是研究腫瘤異質(zhì)性的良好方法。目前，已經(jīng)有科學(xué)家利用異種移植構(gòu)建出了斑馬魚三陰性乳腺癌模型，篩選到了一種有效的CXCR4拮抗劑IT1t，它能夠阻礙三陰性乳腺癌的早期轉(zhuǎn)移[15]，同時(shí)也證明了異種移植的有效性。后來，F(xiàn)ior等用親脂性染料(DiI)標(biāo)記人類腫瘤細(xì)胞并注射到受精48 h后的斑馬魚胚胎卵黃細(xì)胞間隙中，在注射4 d后，幾乎所有的細(xì)胞系都有70%以上的植入率。用5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)標(biāo)記了正在進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)植入的人類腫瘤細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài)。接下來，他們將人腫瘤細(xì)胞注射到標(biāo)記血管系統(tǒng)的Tg(fli：EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，發(fā)現(xiàn)這些腫瘤細(xì)胞聚集區(qū)域形成類似人類腫瘤的血管系統(tǒng)[14]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明人腫瘤細(xì)胞在斑馬魚異種移植中保持其無限增殖及腫瘤生成潛力。

2.3 代謝疾病

斑馬魚同樣可以作為重要的代謝疾病模型[26]。脂肪肝是一種肝臟代謝綜合征，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化或者肝細(xì)胞癌。隨著人們生活水平的不斷提高，脂肪肝的發(fā)病率也在逐漸上升，了解脂肪肝發(fā)病的分子機(jī)制，篩選到能夠治療脂肪肝的小分子藥物，其意義十分重大。研究人員對(duì)高脂肪(HF)飲食和高脂肪加高膽固醇(HFC)飲食喂養(yǎng)的斑馬魚幼魚進(jìn)行比較，模擬了肝脂肪變性的疾病模型，并驗(yàn)證了依澤替米貝(Ezetimibe)和辛伐他汀(Simvastatin)這兩種藥物具有改善HFC誘導(dǎo)的肝脂肪變性的功能[27]。

人類的1型糖尿病是由于胰島β細(xì)胞的T細(xì)胞依賴性破壞引起的。有研究表明，哺乳動(dòng)物中的胰島β細(xì)胞具有再生能力，調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)的一種方法就是誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的內(nèi)源性再生。Rovira等利用Tg(Tp1:hmgb1-mCherry)和Tg(pax6b:GFP)的雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚，跟蹤了次級(jí)胰島(Secondary islets)的形成及β細(xì)胞的早期分化過程，并篩選到了兩種促進(jìn)胰島β細(xì)胞分化的藥物(MPA和DSF)，其中霉酚酸(MPA)通過抑制GTP的產(chǎn)生發(fā)揮功能，而戒酒硫(DSF)通過抑制視黃酸(RA)信號(hào)誘導(dǎo)次級(jí)胰島的早期分化[28]。后來，Wang等同樣得到了兩類促進(jìn)β細(xì)胞分化的小分子，其中I類的小白菊內(nèi)酯(Parthenolide)和硫辛酸(Thioctic acid)通過抑制NF-κB通路增強(qiáng)β細(xì)胞的分化，而II類的帕羅西汀(Paroxetine)和阿米替林(Amitriptyline)可能通過激活5-羥色胺通路促進(jìn)β細(xì)胞的分化[29]。Nath等則是篩選到了一種在斑馬魚體內(nèi)有效的小分子降糖劑阿立西定(Alexidine)，并用其他藥理學(xué)和遺傳手段鑒定出阿立西定通過抑制PTEN樣線粒體磷酸酶PTPMT1來降低斑馬魚體內(nèi)的葡萄糖水平[30]。

鐵調(diào)素(Hepcidin)是由肝細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的一種小分子激素，在調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵代謝的過程中發(fā)揮重要作用。鐵調(diào)素水平升高，會(huì)導(dǎo)致低鐵血癥，相反則會(huì)引起高鐵血癥[31]。Li等在斑馬魚中篩選到3種類固醇分子：表雄醇(Epitiostanol)、孕酮(Progesterone)和米非司酮(Mifepristone)，它們可以增加鐵調(diào)素的生物合成來降低鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ferroportin)的水平，從而進(jìn)一步影響體內(nèi)鐵元素水平，是治療鐵代謝疾病的候選藥物[32]。

線粒體呼吸鏈(Respiratory chain,RC)疾病是一種異質(zhì)性和高度病態(tài)的能量缺乏癥，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育異常、心臟病、肌肉相關(guān)疾病、腎病、肝病、內(nèi)分泌紊亂、聽力及視力障礙等[33-34]，目前尚無有效的治療方法。魚藤酮(Rotenone)、疊氮化物(Azide)、寡霉素(Oligomycin)和氯霉素(Chloramphenicol)分別為線粒體酶復(fù)合物I，IV，V和線粒體翻譯的抑制劑，它們都是線粒體呼吸鏈毒素，Byrnes等利用這四種化合物建立了斑馬魚線粒體功能障礙模型，篩選到普羅布考(Probucol)能夠預(yù)防魚藤酮誘導(dǎo)的腦死亡，并能顯著的挽救魚藤酮或寡霉素暴露下的早期胚胎發(fā)育延遲[35]。

2.4 神經(jīng)疾病

與其他治療領(lǐng)域的藥物相比，神經(jīng)類疾病的候選藥物在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出較高的失敗率，這可能是由于血腦屏障的存在和神經(jīng)性疾病的多基因性。最近，Bruni等報(bào)導(dǎo)了一種可用于神經(jīng)藥物篩選的斑馬魚行為學(xué)分析方法：首先，利用已知的神經(jīng)藥物(如氟哌啶醇，Haloperidol)對(duì)7 d大小的斑馬魚幼魚進(jìn)行處理，然后利用不同波長和頻率的聲覺和視覺組合對(duì)處理組及對(duì)照組幼魚進(jìn)行刺激，依據(jù)其行為學(xué)差異建立起該神經(jīng)藥物的功效參考體系。最后，依據(jù)該參考體系篩選具有類似效果的小分子化合物。作者通過該篩選系統(tǒng)，鑒定出了Finazine等小分子，并在體內(nèi)證明其發(fā)揮類似于氟哌啶醇的藥理作用，表明這套分析方法可用于具有類似機(jī)制的神經(jīng)活性化合物的篩選[36]。

此外，Dinday等利用斑馬魚scn1突變體構(gòu)建了一種癲癇性腦病—Dravet 綜合征的動(dòng)物模型，并利用小分子篩選鑒定出包括芬氟拉明(Fenfluramine)在內(nèi)的多種抗癲癇潛在藥物[37]。最近，Ibhazehiebo報(bào)道了一種組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑伏立諾他(Vorinostat)，這種藥物能同時(shí)減少斑馬魚和小鼠模型中癲癇發(fā)作的頻率，并提出同時(shí)抑制HDAC1和HDAC3可能是一種新的癲癇治療的模式[38]。

2.5 肌肉和骨骼疾病

肌肉是人體重要的運(yùn)動(dòng)器官，肌纖維的形成與微管有非常密切的關(guān)系，微管異?？赡軐?dǎo)致各種肌肉相關(guān)疾病。Richter等結(jié)合原位雜交和突變體表型分析方法，篩選了影響體節(jié)分化的重要信號(hào)分子，鑒定出影響肌節(jié)邊界形成的重要小分子—SB225002，而另一種小分子—XRP44X，則通過影響微管的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響肌肉細(xì)胞的伸長和功能[39]。

骨骼的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，包括成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收，這個(gè)平衡如果被打破就會(huì)出現(xiàn)一系列骨疾病，包括骨硬化、石骨癥和骨質(zhì)疏松癥等。Chen等開發(fā)了斑馬魚抗骨質(zhì)疏松藥物的快速篩選方法，利用鈣黃綠素(Calcein)作為骨礦化評(píng)估的染料，篩選到兩種增加骨礦化的化合物：潘他米丁(Pentamidine)和BML-267，而另外六種化合物RWJ-60475，鹽酸左旋咪唑(Levamisole HCL)，鹽酸四咪唑(Tetramisole HCL)，氰戊菊酯(Fenvalerate)，NSC-663284和BML-267酯(BML-267ester)對(duì)骨礦化有抑制作用[40]。

此外，斑馬魚還被用作多囊腎[41]、視網(wǎng)膜變性[42]、背腹發(fā)育異常[43]等多種疾病模型應(yīng)用于小分子藥物篩選，本文不再一一贅述。

3 結(jié)語

目前為止，研究人員已經(jīng)構(gòu)建出多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚和突變體，這些都將成為良好的人類疾病模型，利用這些疾病模型進(jìn)行藥物篩選的優(yōu)勢非常明顯，首先可以非常清楚的觀察到斑馬魚體內(nèi)組織器官的前后變化，對(duì)藥物效果進(jìn)行合理評(píng)估；其次，可以在活體內(nèi)進(jìn)行藥物毒性和副作用的初步評(píng)估；再者，可以為后續(xù)高等動(dòng)物的臨床試驗(yàn)提供參考，降低成本和工作量。當(dāng)然，這種篩選方法也存在著缺點(diǎn)。第一，目前斑馬魚表型主要通過人工觀察，對(duì)于藥物命中效果的界定比較困難。第二，雖然斑馬魚基因與人類相似度較高，但是實(shí)際編碼的蛋白存在著一定差異，這也就意味著部分適用于斑馬魚的藥物在人類體內(nèi)不能達(dá)到預(yù)期效果?？偟膩碚f，斑馬魚作為疾病模型在藥物篩選上的應(yīng)用前景非常廣闊，相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，將會(huì)有越來越多的藥物被篩選出來，為人類醫(yī)學(xué)研究做出巨大的貢獻(xiàn)。