肝癌微環(huán)境中FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞對腫瘤免疫抑制作用的研究

韓麗芳 趙昌林

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率持續(xù)上升，是全球第三大與癌癥相關(guān)的死亡原因[1]，手術(shù)切除和肝移植是早期肝癌的治療選擇，對于晚期患者全身化療療效差。HCC患者的預(yù)后仍然不容樂觀，尤其是處于晚期的患者，肝癌患者5年生存率低于40%[2]，因此，迫切需要揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制，對完善其治療策略有重要的意義。

調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞（簡稱Tregs）調(diào)控的抑制是免疫介導(dǎo)的炎癥負調(diào)節(jié)的重要機制，在自身免疫和自身炎癥障礙、過敏、急慢性感染、癌癥和代謝性炎癥中發(fā)揮重要作用[3]。Tregs 在腫瘤部位的存在，表明Tregs 可誘導(dǎo)局部免疫耐受。浸潤性Tregs 的存在抑制了保護性抗腫瘤免疫反應(yīng)，并聚集到腫瘤微環(huán)境中，與生存率降低相關(guān)，從肝癌患者中提取的Treg 比來自健康個體的Treg 更具有抑制性[4]。Treg 介導(dǎo)的抑制可能是免疫干預(yù)的重要靶點，阻斷Treg 介導(dǎo)的免疫抑制可增強抗腫瘤作用。

腫瘤微環(huán)境中存在的調(diào)節(jié)性淋巴細胞的種類和數(shù)量與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，有免疫耐受和免疫抑制作用的FOXP3+調(diào)節(jié)T 細胞作為抗腫瘤免疫中的負性調(diào)節(jié)因子，已成為腫瘤免疫學(xué)研究的熱點。T細胞如CD4+FOXP3+和CD4+CD25+FOXP3+，能產(chǎn)生IL-10 和TGF-β，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，阻止自身免疫反應(yīng)，抑制Th-1、Th-17 和Th-2 細胞。此外，Treg 細胞還可能通過激活其他類型的細胞產(chǎn)生IL-10，誘導(dǎo)效應(yīng)細胞凋亡和細胞溶解，并調(diào)節(jié)樹突狀細胞，從而起免疫抑制作用[5，6]。FOXP3+T 發(fā)揮作用的途徑及其與抗腫瘤免疫細胞，如CD8+細胞毒性T 細胞之間的相互作用是目前腫瘤免疫學(xué)研究領(lǐng)域的難點和關(guān)注點之一，因此從該角度出發(fā)探索腫瘤免疫很有意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集我院2012年1月～2018年8月的100 例手術(shù)患者，經(jīng)病理師閱片檢查確診為肝細胞癌。采取肝癌組織以及癌旁組織，癌旁組織為距癌結(jié)節(jié)2cm 以內(nèi)的肝組織，避開壞死區(qū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未行放化療等治療手段；無胰島素依賴型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、甲狀腺自身免疫病等自身免疫性疾病史者；臨床病理資料及隨訪資料均較完整的患者。

1.2 主要試劑及來源 CD8+鼠抗人單克隆抗體、FOXP3+鼠抗人單克隆抗體購自英國Abcam 公司；檸檬酸鹽抗原修復(fù)液（pH 6.0），EDTA 抗原修復(fù)液（pH 9.0），免疫組化染色試劑盒，羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的EliVision 二抗等試劑購自碧云天生物科技有限公司；Trizol Reagent 購自美國Invitrogen公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒、SYBR Green、熒光定量PCR 相關(guān)材料購自北京天根公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化實驗 組織經(jīng)10%甲醛固定24h 后，石蠟包埋，將石蠟組織塊4μm 連續(xù)切片，放60℃恒溫箱烘烤過夜，以防脫片；石蠟切片脫蠟、水化；PBS 洗滌3 次，每次5min；組織切片置于pH 9.0 EDTA 中進行組織抗原微波修復(fù)，先高火煮沸后改為中低火，持續(xù)30min，在室溫下冷卻15min；PBS 洗3 次，每次5min；0.3%過氧化氫室溫20min；PBS 洗3 次，每次5min；抗體孵育4℃過夜；PBS 洗3 次，每次5min；滴加100μl 二抗放大劑室溫10min；PBS洗3 次，每次5min；滴加100μl 二抗多聚酶結(jié)合物室溫10min；PBS 洗3 次，每次5min；滴加100μl DAB 顯色3～5min，自來水沖洗3min；蘇木素細胞核復(fù)染20s，自來水洗10s；浸泡PBS 中15min 返藍；干燥、封片觀察。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定 FOXP3+細胞陽性染色鏡下觀察到細胞核棕黃色或者棕褐色，CD8+T 淋巴細胞陽性染色表現(xiàn)為細胞膜和細胞漿棕黃色或棕褐色著色；先低倍鏡下選取5 個淋巴細胞最豐富的視野，再高倍鏡視野下計各細胞的陽性細胞數(shù)，結(jié)果取5 個視野的平均值。同時分別計算同一視野內(nèi)FOXP3+T 細胞/CD8+T 細胞值。

1.3.3 IL-10 轉(zhuǎn)錄表達檢測 按照Trizol reagent 說明書提取細胞總RNA，檢測RNA 濃度和純度。按cDNA 第一鏈合成試劑盒說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，按SYBR Green 熒光法進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序：95℃ 2min，95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 30s，共40 個循環(huán)，每次退火之后采集熒光信號。反應(yīng)以β-actin 為內(nèi)參照。IL-10 的引物序列為：上游：5'-ACTTGGCAGTGTGGTAGCAG-3'，下游：5'-TGAA CTTGGCAGGCTCGTAA-3'。各組設(shè)置3 個復(fù)孔，并設(shè)置空白對照，記錄各孔CT 值，并采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 全部實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進行處理，分析組間差異。計量資料用±s表示，差異顯著性采用獨立樣本t檢驗。差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 肝癌及癌旁組織中FOXP3+T 細胞和CD8+T 細胞的分布狀態(tài) 腫瘤組織內(nèi)的FOXP3+和CD8+T淋巴細胞呈現(xiàn)出彌散分布狀況，多存在于癌巢及間質(zhì)組織中，鏡下未觀察到明顯的集中分布趨勢；而癌旁組織中卻見到大量的FOXP3+和CD8+T 淋巴細胞密集分布，呈淋巴樣聚集趨勢。

2.2 肝癌及癌旁組織中FOXP3+T 細胞和CD8+T 細胞的數(shù)量分布及二者比值 免疫組化結(jié)果顯示，肝癌及癌旁組織中FOXP3+T 細胞陽性單個高倍視野平均數(shù)分別為26.7±6.2 和53.3±8.7，二者比較差異極顯著（P=0.0074）；肝癌及癌旁組織中CD8+T 細胞陽性單個高倍視野平均數(shù)分別為51.3±7.1 和125.0±10.3，差異極顯著（P=0.0005）。肝癌及癌旁組織中FOXP3+T/CD8+T 值分別為0.519±0.06 和0.422±0.02，差異顯著（P=0.017）。

2.3 肝癌及癌旁組織中IL-10 轉(zhuǎn)錄表達水平 QPCR 檢測肝癌及癌旁組織中IL-10 轉(zhuǎn)錄表達水平，結(jié)果顯示：癌組織中IL-10 mRNA 相對表達量為1.000±0.061，癌旁組織中為0.269±0.034，差異極顯著（P=0.0001）。

3 討論

肝細胞癌（HCC）發(fā)生率占原發(fā)性肝癌的90%以上，是主要的公共衛(wèi)生問題[7]，該病常發(fā)生于慢性乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染。隨著慢性乙肝病毒和丙型肝炎病毒感染的頻率越來越高，越來越多的人在以后的生活中面臨著肝癌的高風(fēng)險[8]。如何有效防治HCC 成為研究的熱點和難點，而FOXP3+調(diào)節(jié)性T 細胞在腫瘤免疫中發(fā)揮的作用近年來成為一個關(guān)注點，研究表明，F(xiàn)OXP3+T 調(diào)控腫瘤免疫的主要途徑有兩條，一是通過細胞與細胞間的直接接觸發(fā)揮細胞抑制作用；另一個則是通過分泌一些細胞抑制因子如IL-10 等抑制細胞毒性T 細胞（CD8+）和自然殺傷細胞（NK）的活化、增殖而發(fā)揮其負性免疫調(diào)控作用[9]。而CD8+細胞在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，在局部抗腫瘤免疫中處于機體免疫系統(tǒng)與腫瘤相互作用的最前沿，其數(shù)量和功能等特征在一定程度上反映了機體抗腫瘤反應(yīng)的性質(zhì)、強度和總體水平[10]。因此檢測FOXP3+T 和CD8+T 細胞的數(shù)量，能直觀地體現(xiàn)出腫瘤微環(huán)境中機體免疫水平的高低。本實驗中，腫瘤組織內(nèi)的FOXP3+和CD8+T 淋巴細胞呈現(xiàn)出彌散分布狀況，而癌旁組織中卻見到大量的FOXP3+和CD8+T 淋巴細胞密集分布，呈淋巴樣聚集趨勢。因此肝癌組織中FOXP3+T 細胞和CD8+T細胞陽性數(shù)量顯著低于癌旁組織，而二者的比值在肝癌組織中顯著高于癌旁組織中。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中FOXP3+T 和CD8+T 細胞與乳腺癌的組織病理學(xué)分級、ER、PR 表達狀態(tài)有顯著相關(guān)性，癌旁組織中FOXP3+T 與ER 表達顯著負相關(guān)，且腫瘤組織中FOXP3+T 數(shù)量、癌旁組織中FOXP3+T/CD8+T細胞比值是乳腺癌患者總生存率及無復(fù)發(fā)生存率的獨立預(yù)后因素[11]。研究表明，腫瘤微環(huán)境中浸潤的FOXP3+調(diào)節(jié)性T 細胞與患者的關(guān)系密切，F(xiàn)OXP3+T 細胞表達升高的患者總體生存率比低表達的患者差[12]，而CD8+T 細胞是機體重要的免疫細胞，能特異性殺傷腫瘤細胞，起到抗腫瘤的效果。本結(jié)果中，腫瘤組織中FOXP3+和CD8+T 細胞比值顯著高于癌旁組織，和前述研究相符，也與兩組細胞的功能密切相關(guān)。

目前，有學(xué)者認為FOXP3+T 細胞在機體中起免疫抑制作用的途徑，可能是通過抑制性細胞因子（TGF-β、IL-10 等）的分泌來降低機體對腫瘤抗原的反應(yīng)及降低效應(yīng)細胞的腫瘤殺傷作用[13]。同時，還有研究表明IL-10 是一個與甲狀腺癌相關(guān)的細胞因子，甲狀腺癌細胞產(chǎn)生高水平的IL-10，甲狀腺細胞產(chǎn)生IL-10 是在腫瘤轉(zhuǎn)化過程中獲得的，在正常甲狀腺組織中，只檢測到IL-4 和IL-10 受體，并未檢測到這種細胞因子，因此IL-10 能夠促進甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展[14]。而且IL-10 可由多種癌細胞自發(fā)分泌，包括黑色素瘤和膠質(zhì)母細胞瘤等，在這些癌細胞中，IL-10 被認為可以促進腫瘤細胞的生存、增殖和遷移[15，16]。由此可知，IL-10 的表達和腫瘤免疫抑制密切相關(guān)，通過抑制機體免疫功能來促進腫瘤發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中FOXP3+T 細胞陽性數(shù)量顯著低于癌旁組織，腫瘤組織內(nèi)的FOXP3+T 淋巴細胞呈現(xiàn)出彌散分布狀況，癌旁組織中呈淋巴樣聚集趨勢，猜測在肝細胞癌組織中，F(xiàn)OXP3+T 淋巴細胞可能通過細胞接觸非依賴性機制發(fā)揮免疫抑制作用，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，即通過分泌細胞抑制因子如IL-10 等發(fā)揮作用，為了驗證這一猜測，我們檢測了腫瘤組織和癌旁組織中的IL-10 轉(zhuǎn)錄表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌組織中IL-10 mRNA 相對表達量顯著高于癌旁組織，本結(jié)果和以往研究結(jié)果相符合，表明IL-10 在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本研究探討了FOXP3+T 細胞與腫瘤免疫的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量及其分泌的免疫抑制因子IL-10 對腫瘤免疫起抑制作用，但本研究未具體探討其調(diào)節(jié)機制或控制Treg 增殖的有效方法，期待能夠做進一步的研究，為設(shè)計更有效的抗腫瘤免疫療法提供依據(jù)。