加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)探究鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長的分子機制?

劉 源, 隋正紅??, 劉昊昕, Sadaf RIAZ,2

(1.中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室， 山東 青島 266003; 2. Department of Microbiology,University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore 54660, Pakistan)

鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumpacificum)作為重要的赤潮甲藻，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，對由其引發(fā)的赤潮的機理的研究受到了研究者的廣泛關(guān)注。研究表明，氮、磷濃度的升高對該藻的生長有促進作用[1]。鐵、錳等微量元素是觸發(fā)塔瑪亞歷山大藻爆發(fā)性增殖的重要因子之一，同樣在鏈狀亞歷山大藻中，錳濃度的提升(18～36 μg/L)，使得其生長速率也隨之上升。Laabir等的研究發(fā)現(xiàn)光照強度從10～90 μmol photons·m-2·s-1的提高，對鏈狀亞歷山大藻的生長有促進作用[2-3]。由于甲藻基因組巨大且復雜，目前的研究發(fā)現(xiàn)鏈狀亞歷山大藻基因組在60 G左右[4]，因此在研究基因調(diào)控機制方面對轉(zhuǎn)錄組測序和研究就顯得更為重要。

表達譜及轉(zhuǎn)錄組通過篩選不同條件下差異表達基因進行后續(xù)分析，所獲得的信息往往是碎片化的，可能會忽略不同處理或不同組織間基因的表達存在的內(nèi)在聯(lián)系或相關(guān)性。WGCNA以比較轉(zhuǎn)錄組或表達譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，是一種從高通量數(shù)據(jù)中挖掘模塊信息的算法。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析重點關(guān)注差異表達基因不同，WGCNA分析采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)或其他統(tǒng)計學方法衡量基因間的表達關(guān)系，從而構(gòu)建基因共表達模塊(Module)，其分析可以覆蓋整個轉(zhuǎn)錄組，并將復雜的數(shù)據(jù)進行歸納整理，從而對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組分析進行補充并獲取新的發(fā)現(xiàn)。在高等植物中，通過轉(zhuǎn)錄組測序找到了羽衣甘藍不同組織的芥子油苷的代謝的相關(guān)基因，隨后對轉(zhuǎn)錄組測序得到的相關(guān)合成基因進行WGCNA分析發(fā)現(xiàn)，根以及衰老的葉子可能是芥子油合成發(fā)生的主要組織[5]。WGCNA理論最早在2005年提出，隨后在理論的基礎(chǔ)上完成了基于R語言完成相關(guān)軟件包的開發(fā)[6]。在WGCNA的分析過程中，首先構(gòu)建基因共表達模塊(Module)，基因模塊中含有一組具有似表達模式的基因。模塊中的樞紐基因(Hub gene)作為模塊中與其他基因連接最緊密的基因往往決定了一個模塊的特性，更容易發(fā)現(xiàn)與性狀相關(guān)的生物學意義。

WGCNA被廣泛應用在醫(yī)學研究方面。在膠質(zhì)母細胞瘤的研究中，通過對100多位患者的基因表達數(shù)據(jù)的WGCNA分析，發(fā)現(xiàn)了一個癌癥相關(guān)的基因模塊，而該模塊的樞紐基因也成為了治療膠質(zhì)母細胞瘤的關(guān)鍵靶基因[7]。此外，在阿爾茲海默癥、骨質(zhì)疏松癥等的研究中[8-9]，也找到了與治病相關(guān)聯(lián)的基因及治療的靶點。在植物中，通過WGCNA分析在擬南芥中找到了參與中種子萌發(fā)的基因模塊，并由此對種子萌發(fā)過程中基因調(diào)控機制進行了深入的研究[10]。在蘋果中，利用WGCNA分析找到了與蘋果酸味產(chǎn)生相關(guān)的基因模塊。

本研究通過模擬赤潮爆發(fā)的條件對鏈狀亞歷山大藻進行表達譜測序，利用表達譜測序后得到的基因表達量數(shù)據(jù)，計算基因間的相關(guān)性，從而構(gòu)建基因共表達模塊，并將模塊與鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(EG)相關(guān)聯(lián)，對顯著性相關(guān)的模塊內(nèi)的樞紐基因進行篩選并進行功能富集分析，以探索鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長的分子機制。

1 鏈狀亞歷山大藻表達譜測序

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

鏈狀亞歷山大藻藻株來源于中國海洋大學海洋生物遺傳與育種教育部重點實驗室。具體培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)基：f/2培養(yǎng)基(不加硅)；光照強度：30 μmol·m-2·s-l；溫度：(20±1)℃；光暗周期：12 h︰12 h。

1.2 鏈狀亞歷山大藻的處理及藻細胞收集

鏈狀亞歷山大藻于f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將其中生長活力較好的藻在黑暗條件下進行48 h同步化處理，使其處于同一生長時期。同步化完成后以2×106個/L的濃度將藻接種于高磷高錳(M)、高光(G)、低氮(N)、低磷(P)以及正常培養(yǎng)(C)這五個處理條件下進行培養(yǎng)(見表1)，每個處理條件設(shè)置3個平行。

隨后在鏈狀亞歷山大藻生長對數(shù)期(第12天)用除菌方法收集藻細胞，方法如下：在20 ℃條件下，用經(jīng)過無菌處理的10 μm孔徑篩絹過濾藻液，每過濾100 mL藻液用300 mL相應的無菌培養(yǎng)基進行沖洗，對沖洗后的藻液用50 mL無菌培養(yǎng)基(含有0.05%Tween-80和0.01 mol/L EDTA)懸浮30 min，超聲破碎1 min(50 w，超聲時間5 s，間隔時間5 s)，隨后用溶菌酶(0.5 mg/mL)在20 ℃下處理10 min，加入0.25% SDS處理10 min，用相應的無菌培養(yǎng)基沖洗，去除試劑殘留。隨后除菌后的藻液經(jīng)0.01%的吖啶橙染色2 min后，在熒光顯微鏡下進行觀察[11]，篩選其中的無菌樣品進入后續(xù)實驗。

表1 表達譜所需樣品的處理條件Table 1 Samples used for DGE analysis

收集無菌處理后的鏈狀亞歷山大藻，每個處理條件的1個平行即為1個樣品，每個樣品中約含5×106個藻細胞，共計15個樣品保存在液氮中，用于后續(xù)RNA文庫的構(gòu)建。

1.3 總RNA的提取及文庫構(gòu)建

1.3.1 總RNA的提取及檢測 采用RNAiso Plus (Trizol) (TaKaRa)法進行對15個樣品的總RNA進行提取，得到的RNA用DNase I(TaKaRa)進行DNA消化，并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳150 V，10 min進行檢測，用Nano Drop2000進行RNA濃度和純度檢測。

1.3.2 文庫構(gòu)建 使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB)試劑盒按照說明書步驟進行文庫的構(gòu)建。

用Oligo(dT)磁珠對總RNA中的mRNA進行富集，用Fragmentation buffer將mRNA隨機打斷成短片段，利用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈，隨后加入dNTPs、DNA polymerase I、RNaseH合成第二條鏈。連接測序接頭，經(jīng)過PCR擴增，增加模板量，構(gòu)建cDNA測序文庫。

1.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

對構(gòu)建的15個cDNA文庫用Illumina Genome Analyzer進行單末端100 bp測序。采用FastQC(v0.11.5)軟件對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，隨后用FASTX-Toolkit(v0.0.6)去除接頭序列，去除N堿基所占比例大于10%的序列，去除低質(zhì)量序列，得到Clean reads。

2 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析

2.1 WGCNA分析流程

分析流程見圖1。

圖1 加權(quán)基因共表達分析流程Fig.1 The process of WGCNA

2.2 WGCNA分析方法

數(shù)據(jù)預處理以實驗室已經(jīng)測序得到的比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRX368254)為參考序列，通過軟件RSEM(v1.3.0，以期望最大值算法為基礎(chǔ))，計算表達譜所有reads的表達量情況[12]。

利用WGCNA軟件包中的pickSoftThreshold函數(shù)進行軟閾值的計算，軟閾值的標準是使共表達網(wǎng)絡(luò)要符合無尺度分布[13-14]。

利用R語言的moduleEigengenes函數(shù)計算基因模塊的特征向量基因，模塊特征向量基因代表了模塊內(nèi)所有基因的一種表達模式，再引入樣品的特征，計算特征向量基因與樣品特征之間的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)越高代表模塊與樣品特征越關(guān)聯(lián)，對其中顯著相關(guān)模塊進行后續(xù)的模塊基因表達和功能富集分析。利用plotME和barplot函數(shù)將顯著相關(guān)模塊中的基因依據(jù)其在不同處理條件下的表達量進行聚類分析，并繪制各個模塊的特征向量基因在不同處理條件下的柱狀圖以分析其表達情況。

對與性狀顯著相關(guān)的每個模塊利用R語言包ClusterProfiler(v3.6.0)中的enrichKEGG函數(shù)進行KEGG富集分析。利用基于基因顯著性和模塊身份的函數(shù)NetworkScreening計算基因與模塊的相關(guān)性，以相關(guān)性q值為基礎(chǔ)進行樞紐基因的篩選。采用Cytoscape軟件中的BinGO插件，對與性狀顯著相關(guān)模塊的樞紐基因進行GO富集分析[16]，富集分析的顯著性水平p<0.05。

2.3 統(tǒng)計學處理

實驗中的顯著性水平的標準為p<0.001，以錯誤發(fā)現(xiàn)率 (False discovery rate，F(xiàn)DR)對p值進行驗證得到q值，用q<0.05來排除假陽性。

3 結(jié)果

3.1 不同處理條件下鏈狀亞歷山大藻的生長

對五個處理條件下的鏈狀亞歷山大藻進行隔天計數(shù)并繪制生長曲線(見圖2)，以觀察其生長狀態(tài)，確定取樣時間。通過繪制的生長曲線可以看出，在高磷高錳以及高光的誘導條件下，鏈狀亞歷山大藻的生長速率以及細胞數(shù)量都高于其他處理條件，表現(xiàn)出了爆發(fā)性生長的特征，而在低氮和低磷處理條件下，該藻的生長速率較慢，通過顯微鏡觀察在15天后，該藻開始逐漸衰亡，出現(xiàn)了大量的死細胞，通過生長曲線確定選取第12天作為取樣時間進行后續(xù)實驗。

圖2 不同培養(yǎng)條件下鏈狀亞歷山大藻生長曲線Fig.2 Growth curve of A. pacificum under five treatments

3.2 WGCNA數(shù)據(jù)的預處理及去除離群樣本

將15個樣品的表達譜數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，去除低表達量(RPKM值低于3.57)的基因，并篩選不同處理條件下，基因表達量方差較大的前25%的基因(表明在不同處理間變異性較高)，隨后利用R語言中的WGCNA軟件包gsg數(shù)據(jù)過濾去除離群值，共得到16 326個基因用于網(wǎng)絡(luò)基因的構(gòu)建。

對15個樣品進行聚類分析，繪制聚類圖，以檢驗樣品組間的相關(guān)性，去除離群樣品，并依據(jù)樣品的處理條件，標注其生物學特征。通過模擬赤潮爆發(fā)的條件，在培養(yǎng)過程中，鏈狀亞歷山大藻在高磷高錳以及高光的誘導條件下的生長速率和細胞總數(shù)要顯著高于其他3個處理條件，表現(xiàn)出了爆發(fā)性生長的特性，因此將高磷高錳誘導以及高光誘導兩個處理條件作為爆發(fā)性生長的樣品特征(Explosive growth，EG)。聚類分析顯示，沒有離群樣本的存在(見圖3)，15個樣品組間的相關(guān)性較好，均可以用于后續(xù)的分析。圖中紅色代表高光和高磷高錳處理的爆發(fā)性生長條件。

3.3 基因共表達模塊的構(gòu)建

在確定軟閾值后，依據(jù)確定值進行基因模塊的構(gòu)建。首先計算兩兩基因間的相似性系數(shù)以及相異度，從而構(gòu)建層次聚類樹。最終得到35個相關(guān)性基因模塊(見圖4)，不同的顏色代表不同的基因共表達模塊，灰色模塊為未被分配的基因。

統(tǒng)計得到的各個基因模塊的基因個數(shù)，在這35個基因模塊中，基因數(shù)目從32到2 812個不等(見圖5)。

3.4 基因模塊與性狀的關(guān)聯(lián)分析

將每個基因模塊的特征向量基因與樣品的特征相關(guān)聯(lián)，從而找到與樣品特征密切相關(guān)的基因模塊。圖中顏色越紅代表顯著相關(guān)性越高，以p<0.001為顯著性相關(guān)的篩選標準，分析得到了與鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(EG)顯著性相關(guān)的6個模塊，分別是blue4(0.79，p=8e-05)、blue(0.74，p=4e-04)、darkseagreen3(0.7，p=0.001)、firbrick3(0.79，p=8e-05)、black(0.92，p=5e-08)、darkgrey(0.82，p=3e-05)(見圖6)。

圖3 15個樣品聚類結(jié)果及樣品特征Fig.3 The phylogenetic tree and the information of the 15 samples

(Dynamic Tree Cut代表初步識別的基因模塊；Merged Dynamic為融合相似模塊后的基因表達模塊。Dynamic Tree Cut represent the initial identification of the gene module，merged dynamic represent merged similar modules. )

圖4 基因共表達網(wǎng)絡(luò)聚類樹
Fig.4 WGCNA cluster tree for the samples

3.5 與鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長相關(guān)的共表達模塊

基于基因模塊的特征向量基因與樣品特征關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，對在高磷高錳誘導、高光誘導條件下6個顯著性相關(guān)模塊(P<0.001)的基因數(shù)進行了統(tǒng)計(見表2)。由表2可見，模塊blue4中包含的基因最多有2 812個，而darkgrey模塊最少有360個。對這6個模塊的基因及特征向量基因在表達譜15個處理條件下的相對表達量分別進行熱圖層次聚類和柱狀圖分析，結(jié)果顯示這六個模塊在高磷高錳誘導以及高光誘導條件下均上調(diào)表達(見圖7)。

圖5 各模塊基因數(shù)分布Fig.5 Number of genes in the 35 modules

圖6 各模塊特征向量與樣品特征間的相關(guān)性分析Fig.6 Diagram of correlation between modules and sample treatment information

表 2 6個顯著性相關(guān)模塊的基因數(shù)統(tǒng)計Table 2 The numbers of genes in 6 modules

對6個模塊的基因分別進行KEGG富集分析，其中模塊blue4中的基因顯著富集到核糖體的生物合成、細胞骨架調(diào)節(jié)途徑(q<0.05)，而模塊black顯著富集到了光合作用中的碳固定途徑、磷酸戊糖途徑(q<0.05)(見圖8)。

以基因與性狀的相關(guān)性q值為基礎(chǔ)對各個模塊中的基因進行排序，每個模塊中選取排序后前10%的基因作為樞紐基因，以6個顯著性相關(guān)模塊中的樞紐基因為研究對象，進行GO富集分析(見圖9)，圖中黃色越深代表富集越顯著，圓圈大小表示GO條目的層級關(guān)系(p<0.05)。在分子功能方面，樞紐基因顯著性富集在了結(jié)合活性(p=2.70e-6)，電子轉(zhuǎn)運活性(p=5.20e-6)以及催化活性(p=3.20e-5)；在生物過程方面，樞紐基因富集在信號轉(zhuǎn)導(p=6.10e-6)，蛋白質(zhì)代謝(p=6.60e-6)，碳水化合物代謝(p=7.30e-6)以及大分子物質(zhì)的合成過程(p=8.20e-6)；在細胞組分方面，樞紐基因主要富集在核糖體(p=4.70e-5)、蛋白復合體(p=6.20e-5)以及核糖核蛋白復合體(p=8.20e-5)等。

(15個處理條件為低氮(N1、N2、N3)，低磷(P1、P2、P3)，正常培養(yǎng)(C1、C2、C3)，高磷高錳誘導(M1、M2、M3)和高光誘導(G1、G2、G3)。15 treatments contain low nitrogen(N1、N2、N3)，low phosphorus(P1、P2、P3)，normal condition(C1、C2、C3)，high phosphorus(M1、M2、M3)and hight light(G1、G2、G3).)

圖7 顯著性相關(guān)模塊的基因在表達譜15個處理條件下的聚類分析
Fig.7 Cluster analysis of the genes in 6 modules under 15 different treatments of DGE analysis

(Rich factor 是該模塊樞紐基因中位于該通路的基因數(shù)目與所有該通路的基因數(shù)的比值。a. Blue4模塊；b. Black模塊。Rich factor represent the ratio of the hub genes in this pathway and all the genes of this pathway. a. Blue4 module；b. Black module.)

圖8 模塊blue4和black的KEGG富集分析
Fig.8 KEGG enrichment analysis of module black

(a. 分子功能；b. 生物過程；c. 細胞組分。a. Molecular function; b. Biological process; c. Cellular component.)圖9 樞紐基因GO富集分析圖 Fig.9 GO enrichment analysis of hub genes

對富集到的GO條目中顯著性p<5e-4的基因進行統(tǒng)計(見表3)，在生物過程基因包括涉及蛋白代謝的伴侶蛋白和預測蛋白，涉及碳水化合物代謝的6磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶，涉及信號傳導的磷酸二酯酶(PDE)(同時富集在分子功能的催化活性)、鈣離子依賴性激酶(同時富集在分子功能鈣離子結(jié)合活性)，以及涉及翻譯過程的40s及60s核糖體蛋白(同時富集在細胞組分的核糖體上)；在分子功能方面基因涉及電子轉(zhuǎn)運活性的光系統(tǒng)1的鐵硫中心，鐵氧還蛋白還原酶和紅素氧還蛋白，涉及蛋白結(jié)合活性的類泛素蛋白。

表3 爆發(fā)性生長條件下樞紐基因GO富集結(jié)果(部分)Table 3 GO enrichment of hub genes in response to explosive growth of A. pacificum

續(xù)表3

GO編號及過程GO ID and process基因IDGene ID功能Functionp值p-value分子功能Molecular Function細胞組成CellularComponentElectron carrier activity (GO:0009055)Catalytic activity (GO:0003824)Protein binding (GO:0005515)Calcium ion binding (GO:0005509)Ribosome (GO:0005840)Algae_064-3_Unigene_BMK.26288photosystem I iron-sulfur center1.40e-8Algae_064-1_Unigene_BMK.49816ferredoxin oxidoreductase4.10e-7Algae_064-1_Unigene_BMK.42171Rubredoxin-22.70e-6Algae_064-1_Unigene_BMK.1603Calcium/calmodulin-dependent 3′,5′-cyclic nucleotide phosphodiesterase6.60e-8Algae_064-3_Unigene_BMK.29372hypothetical protein6.10e-6Algae_064-3_Unigene_BMK.44168small ubiquitin-like protein1.70e-5Algae_064-2_Unigene_BMK.30688protein kinase6.12e-6Algae_064-1_Unigene_BMK.10610calcium-dependent protein kinase7.50e-6Algae_064-3_Unigene_BMK.2010660S ribosomal protein4.10e-9Algae_064-3_Unigene_BMK.1520540S ribosomal protein4.90e-9Algae_064-3_Unigene_BMK.174060S ribosomal protein4.60e-5Algae_064-3_Unigene_BMK.1400240S ribosomal protein7.70e-5Algae_064-3_Unigene_BMK.1356940S ribosomal protein9.50e-5

對6個顯著相關(guān)模塊中q值排序前3的hub基因進行統(tǒng)計(見表4)，模塊blue4中包括60s核糖體蛋白亞基、核糖體蛋白，說明該模塊可能與核糖體相關(guān)。模塊Firebrick3中包括類形成蛋白、端錨聚合酶等。Darkgrey模塊中基因包括轉(zhuǎn)錄起始因子、泛素激活酶以及粘蛋白。Darkseagreen3模塊可能與蛋白質(zhì)的合成加工相關(guān)，基因包括多聚泛素、熱激蛋白(HSP)。Blue模塊包含光捕獲蛋白、細胞色素復合體b6f等，該模塊可能與電子轉(zhuǎn)運相關(guān)。模塊Black中的基因包括轉(zhuǎn)酮醇酶、甘油醛3磷酸脫氫酶以及輔酶A轉(zhuǎn)移酶蛋白家族。

表4 與爆發(fā)生長顯著相關(guān)模塊前3個樞紐基因信息Table 4 The top 3 hub genes of modules significant correlate to explosive growth

續(xù)表4

分子Module基因Gene ID注釋Annotation藍色模塊Blue moduleAlgae_064-3_Unigene_BMK.26938Light-harvesting proteinAlgae_064-3_Unigene_BMK.88955Light-harvesting proteinAlgae_064-2_Unigene_BMK.6496cytochrome b6f complex黑色模塊Black moduleAlgae_064-2_Unigene_BMK.37578TransketolaseAlgae_064-3_Unigene_BMK.73675Ribulose-1,5-biphosphate carboxylaseAlgae_064-2_Unigene_BMK.61673Phosphoribulokinase

4 討論

在鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長條件下，樞紐基因中的光捕獲蛋白以及細胞色素復合體b6f參與到了光合作用的電子傳遞過程，光捕獲蛋白捕獲光能并將其轉(zhuǎn)移到光系統(tǒng)中以開始光合作用的光反應，同時光捕獲蛋白可以維持類囊體膜的結(jié)構(gòu)[17]?；贕O富集分析(見表3)，紅素氧還蛋白和鐵氧還蛋白氧化還原酶顯著富集在電子轉(zhuǎn)運活性。紅素氧還蛋白屬于鐵硫蛋白家族，在光合作用和非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用，最初植物中的紅素氧還蛋白由擬南芥類囊體上分離得到[18]，隨后在聚球藻的研究中發(fā)現(xiàn)該蛋白可能參與光系統(tǒng)I的組裝，它的缺失將導致光系統(tǒng)I功能喪失[19]。在植物光合作用中，鐵氧還蛋白還原酶接受鐵氧還蛋白傳遞的電子使NADP+還原為NADPH，同時基于KEGG富集分析，顯著相關(guān)模塊的基因富集在光合作用碳固定途徑，而光合電子傳遞為其提供了所需的NADPH和ATP，保證了碳固定途徑的順利進行?；趯δK基因的GO及KEGG富集分析，以及對樞紐基因的分析，說明光合作用在鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長方面起到重要作用。

樞紐基因中的40s以及60s核糖體蛋白亞基，在GO富集分析(見圖9)中顯著富集在生物過程中的翻譯過程以及細胞組分的核糖體中，基于KEGG分析(見圖8)參與了核糖體的生物合成，說明了核糖體的生物合成與細胞生長息息相關(guān)。

通過GO富集分析(見表3)，發(fā)現(xiàn)了與鈣離子結(jié)合活性相關(guān)的基因鈣離子依賴性激酶(CaMK)以及與信號傳導相關(guān)的PDE，這兩個基因均受到鈣離子/鈣調(diào)蛋白信號通路的調(diào)控，從而參與到細胞周期調(diào)控中。PDE是一類催化水解環(huán)核苷酸(cAMP)的關(guān)鍵酶，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP的水平，影響細胞的生理功能[20]，研究發(fā)現(xiàn)cAMP的含量隨著細胞周期的進行而改變，在S期之前，其含量的變化與DNA的合成相關(guān)，在纖細裸藻中，cAMP含量的增加會抑制DNA的合成，使細胞分裂停在G2期，而其含量下降，細胞周期也會隨之恢復。鈣離子及鈣調(diào)蛋白信號通路參與了細胞內(nèi)眾多的生理過程，同時在細胞周期調(diào)控方面也起到了重要作用，受其調(diào)控的與細胞周期相關(guān)的CaMK和PDE的發(fā)現(xiàn)，說明了相關(guān)的信號通路在鏈狀亞歷山大藻細胞周期調(diào)控方面也有重要作用。

熱激蛋白常以分子伴侶的形式存在，作為保護蛋白與其他蛋白結(jié)合從而穩(wěn)定結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)，在細胞中參與蛋白的合成、蛋白的翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)的跨膜運輸?shù)冗^程。其中Hsp90是真核生物中含量最豐富的蛋白之一，在真核生物中普遍存在，其活性受到ATP酶的調(diào)控，參與蛋白折疊、降解過程，與植物發(fā)育過程中參與多種酶以及激素受體的蛋白成熟過程，能促進信號肽的成熟，促進肽鏈的正確折疊，維持和穩(wěn)定蛋白構(gòu)象[21]。目前研究發(fā)現(xiàn)Hsp90參與到細胞周期調(diào)控，并受到鈣調(diào)蛋白的作用參與信號轉(zhuǎn)導過程[22]。Hsp70參與新生肽鏈的合成，調(diào)控新生蛋白質(zhì)的折疊以及蛋白的跨膜運輸?shù)冗^程[23]，在細胞快速生長階段，需要大量蛋白質(zhì)的合成，而Hsp90和Hsp70在蛋白質(zhì)的合成加工方面的作用有助于保證蛋白質(zhì)的正確折疊。

通過對hub基因進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，大量的hub基因未被注釋功能或注釋為預測蛋白(Hypothetical protein)，如在blue4模塊中，對q值前20的hub基因進行統(tǒng)計并分析后發(fā)現(xiàn)，其中有11個基因未被注釋。雖然有未注釋蛋白存在，但同屬于一個模塊的基因在表達量上存在相關(guān)性，意味著這些基因在功能方面有相似性，可以由此來推測未注釋基因的功能。

通過分析比較表達譜數(shù)據(jù)，基于WGCNA分析，核糖體的合成、磷酸戊糖途徑、光合作用的碳固定途徑起到了重要的調(diào)控作用，同時在表達譜測序篩選得到的差異基因外，樞紐基因中與蛋白質(zhì)合成加工相關(guān)的熱激蛋白以及參與光合作用光反應的熒光素結(jié)合蛋白以及電子傳遞蛋白的發(fā)現(xiàn)，更有助于完善鏈狀亞歷山大藻光合作用以及蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控機制，為進一步闡明這些調(diào)控機制對細胞生長的影響提供基礎(chǔ)。

5 結(jié)語

本研究以鏈狀亞歷山大藻模擬赤潮爆發(fā)條件下的表達譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，首次將WGCNA分析用于赤潮爆發(fā)的機制的研究中。依據(jù)WGCNA分析的流程構(gòu)建了基因的共表達網(wǎng)絡(luò)，共得到了35個基因共表達模塊。將基因模塊與鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長特征相關(guān)聯(lián)。通過功能富集分析以及對模塊中樞紐基因的功能分析，與爆發(fā)性生長相關(guān)的樞紐基因涉及核糖體的生物合成、碳水化合物代謝(碳固定途徑、磷酸戊糖途徑)、光合作用光反應的電子傳遞過程以及蛋白質(zhì)的合成和加工等，這些途徑為細胞的快速增殖提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時，樞紐基因中包含了大量的未知功能的基因，雖功能未知，但通過分析基因共表達模塊，這些基因在調(diào)控細胞生長方面同樣存在重要作用，對這些基因的進一步研究將有助于挖掘鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長的潛在的分子機制。