組織與細(xì)胞培養(yǎng)在植物育種中的研究進(jìn)展及其應(yīng)用

龔建軍，鐔美霞

（武威職業(yè)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)系，甘肅 武威 733000）

植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)體系在育種研究和商業(yè)應(yīng)用中具有巨大的潛能，在商業(yè)應(yīng)用和細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)等基本研究中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。自德國(guó)植物學(xué)家G.Haberlandt發(fā)表關(guān)于植物葉肉細(xì)胞培養(yǎng)的研究開始，植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)過(guò)110多年的發(fā)展，現(xiàn)在已成為科學(xué)研究的工具和加快生產(chǎn)進(jìn)程的途徑。隨著植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的逐漸完善，其在植物遺傳育種等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣，為植物新類型的創(chuàng)造和培育優(yōu)良作物品種以及生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)（如醫(yī)藥、香料等植物化學(xué)成分）等領(lǐng)域開辟了新的途徑；隨后，在生產(chǎn)中涌現(xiàn)出許多應(yīng)用成功的案例，發(fā)展速度比預(yù)期要迅速，但也面臨很多困難和障礙。目前，植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)在植物育種方面取得了以下幾個(gè)方面的較大進(jìn)展。

1 種質(zhì)資源保護(hù)

種質(zhì)資源是人類用以植物遺傳改良和發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必不可少的繁殖材料。植物育種工作離不開種質(zhì)資源的定期繁育復(fù)壯。種質(zhì)資源種類繁多，特征特性各異，保護(hù)、開發(fā)利用種質(zhì)資源關(guān)系到人類的生存條件和經(jīng)濟(jì)條件。一方面常規(guī)的種質(zhì)資源收集、保存、研究和利用，需要建立保護(hù)圃或保護(hù)地，不僅需要大量的人力、基礎(chǔ)設(shè)施和技術(shù)路線研究，而且容易遭受自然災(zāi)害威脅、病蟲害侵襲，造成有益種質(zhì)資源的丟失；另一方面，科研單位缺乏種質(zhì)資源保護(hù)配套設(shè)施，保存的數(shù)量有限，時(shí)間短，也容易丟失。據(jù)報(bào)道，若要保存800個(gè)品種的葡萄種質(zhì)，需占土地1 hm2，養(yǎng)護(hù)費(fèi)用十分高昂。植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)所用的試驗(yàn)材料取材少，利用不同外植體培養(yǎng)結(jié)合低溫、超低溫冷凍貯藏可保存種質(zhì)資源，保存和繁殖所需的空間比田間栽培要小得多，生長(zhǎng)周期短且繁殖系數(shù)大，培養(yǎng)效果好，病蟲害少，便于種質(zhì)資源的交換和轉(zhuǎn)移。如將葡萄莖段經(jīng)組培形成的組培苗保存在試管中，溫度調(diào)控在9 ℃以下，植株就會(huì)停止生長(zhǎng)，每年只需轉(zhuǎn)管1次，這樣800個(gè)葡萄品種，每個(gè)品種6個(gè)重復(fù)，只占用2 m2。許多植物都可采用這樣的試管繁殖方式，低溫保存，每年轉(zhuǎn)接1～2次，就可長(zhǎng)期保存，也可以隨時(shí)把培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到常溫的條件下，利用組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將其進(jìn)行快速繁殖并廣泛應(yīng)用。

2 優(yōu)良品種快繁及脫毒

利用組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖，得到無(wú)病毒植株。由于脫毒苗能較好保持原有的優(yōu)良性狀，植物快繁及脫毒已成為解決病毒病危害和品種退化的一個(gè)新途徑。植物組織與細(xì)胞經(jīng)初代及繼代培養(yǎng)獲得完整的植株，遺傳性穩(wěn)定，突出特點(diǎn)是在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量龐大的新株系；因此，對(duì)一些繁殖系數(shù)低、不能用種子繁殖的植物，這項(xiàng)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)的最佳途徑，比常用方法繁殖的速度快數(shù)百萬(wàn)倍，是植物組培快繁技術(shù)應(yīng)用在生產(chǎn)實(shí)踐上最廣泛、成效最大的實(shí)例。1960年Morel提出離體無(wú)性繁殖蘭花的方法。Seeni等[1]在火焰蘭的葉基部成功誘導(dǎo)出嫩芽，獲得再生植株。Chang等[2]以寒蘭根狀莖為材料經(jīng)培養(yǎng)獲得再生植株。

用于組織與細(xì)胞培養(yǎng)快繁的植物種類繁多，包括花卉觀賞植物（草本、喬木、灌木和藤本）、經(jīng)濟(jì)作物（蔬菜、果樹、大田作物）及藥用植物（鴨腳樹、人參、紅豆杉等）。脫毒苗可以提高產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)量，目前國(guó)際上無(wú)病毒苗木研究機(jī)構(gòu)有：國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（IITA）、國(guó)際馬鈴薯研究中心（CIP）、亞洲蔬菜研究中心（AYRDC）。自1978年以來(lái)，美國(guó)、新西蘭、荷蘭等國(guó)家已經(jīng)開始用不同樹木的組培苗進(jìn)行小面積造林，1983年我國(guó)的林木組培苗研究已從實(shí)驗(yàn)室走向工廠化大生產(chǎn)、走向市場(chǎng)。離體快繁的特點(diǎn)是培養(yǎng)條件可以人為控制，生長(zhǎng)周期短，經(jīng)濟(jì)高效，管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制。對(duì)于名優(yōu)特植物、常規(guī)繁殖容易但易感染病毒的植物、雜合型園藝植物、有性不親和與不育的基因型植物等，離體快繁是一個(gè)有效的手段，并將帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益[3]。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，許多無(wú)性繁殖植物，如馬鈴薯、甘薯、草莓、大蒜等都帶有病毒，根據(jù)病毒在植株中分布不均勻，但在植株生長(zhǎng)點(diǎn)附近細(xì)胞的病毒濃度很低且病毒的含量隨植株部位和年齡而異的原理，通過(guò)莖尖分生組織培養(yǎng)或結(jié)合其他處理，再生植株可有效脫除病毒，獲得脫病毒小苗。馬鈴薯的脫毒培養(yǎng)是莖尖培養(yǎng)最成功的案例之一。目前，生產(chǎn)上培育并已成功應(yīng)用的無(wú)病毒植株有馬鈴薯、甘薯、大蒜、草莓、甘蔗、菠蘿、香蕉等，一般草莓脫毒苗可以提高20%～50%的產(chǎn)量，并且果個(gè)大、形好、畸形果少、口味好[4]。外植體已不僅限于莖尖，未成熟或成熟的胚、葉（花）原基、單個(gè)游離細(xì)胞、原生質(zhì)體等都可以應(yīng)用這一培養(yǎng)技術(shù)。

3 誘發(fā)和離體篩選突變體

細(xì)胞和組織培養(yǎng)是擴(kuò)大變異的有效途徑，誘發(fā)和離體篩選突變體技術(shù)是一種高效的種質(zhì)資源創(chuàng)新方法，為抗逆育種提供了新思路。利用細(xì)胞和組織培養(yǎng)中培養(yǎng)的細(xì)胞易受培養(yǎng)條件和誘變因素（如射線、化學(xué)物質(zhì)、脅迫處理等）的影響而發(fā)生變異的原理，進(jìn)行突變的誘發(fā)，進(jìn)而從中篩選出有用的突變體，最終育成新品種。大量試驗(yàn)表明，利用離體篩選技術(shù)獲得的突變體在創(chuàng)新抗性材料方面發(fā)揮了重要作用。目前，已篩選出的抗性突變體類型有：抗煙草花葉病毒（TMV）和抗除草劑的番茄，抗馬鈴薯X病毒（PVX）和馬鈴薯Y病毒（PVY）的馬鈴薯，辣椒、番茄、亞麻等抗寒突變體，番茄、棉花等耐鹽突變體，茄子抗線蟲、螨蟲和黃萎病突變體，甘藍(lán)型油菜抗Basta除草劑和抗菜蛾害蟲等多種變異類型。一些作物離體培養(yǎng)期間體細(xì)胞無(wú)性系變異頻率高達(dá)10%～15%，從中可獲得大量有價(jià)值的突變體材料，經(jīng)過(guò)定向選育及抗性鑒定，篩選出一定的目標(biāo)性狀，得到新種質(zhì)變異體[4]。與誘變育種相比，誘發(fā)和離體篩選突變體技術(shù)具有變異頻率高、育種周期短、育種方向性強(qiáng)等優(yōu)越性，已成為細(xì)胞工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，用來(lái)實(shí)現(xiàn)作物品種改良，獲得更多有價(jià)值的抗病種質(zhì)材料，在基因資源等方面的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。

4 克服遠(yuǎn)緣雜交困難

植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)和遠(yuǎn)緣雜交相結(jié)合是克服遠(yuǎn)緣雜交育種中雜種夭亡、雜種后代中間類型不穩(wěn)定等困難的有效途徑。試管授粉受精和幼胚培養(yǎng)作為解決種間、屬間等遠(yuǎn)緣雜交中雜種胚停止發(fā)育和雜種F1不結(jié)實(shí)等問(wèn)題的手段，克服了常規(guī)有性的遠(yuǎn)緣雜交雜種后代分離時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定慢的缺點(diǎn)，在很多種植物上獲得了成功。Laibach培養(yǎng)亞麻種間雜交幼胚獲得成功并得到了雜種，證明胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)緣雜交上可利用，從而開創(chuàng)了植物胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用。

常規(guī)育種中雜交不親和是很大的障礙，胚胎在發(fā)育初期就出現(xiàn)障礙并停止發(fā)育，導(dǎo)致很難進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育形成幼苗，但通過(guò)胚珠培養(yǎng)或子房培養(yǎng)，可促進(jìn)原胚繼續(xù)胚性生長(zhǎng)，使幼胚發(fā)育成熟，挽救瀕臨中途敗育的雜種胚，獲得遠(yuǎn)緣雜種植株，也是進(jìn)行種子發(fā)育機(jī)理等方面研究的一個(gè)有效方法，為試管受精提供一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù)。1996年，用桃的胚培養(yǎng)成功克服了雜種胚敗育的問(wèn)題；甜菜（野生種×栽培種）后代雜種胚離體培養(yǎng)誘導(dǎo)得到再生植株，為野生甜菜資源潛力的發(fā)掘利用開辟了新的途徑[5]。植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)在遠(yuǎn)緣雜交育種中顯著地?cái)U(kuò)大和豐富了植物育種的基因庫(kù)，改良了栽培品種的品質(zhì)，合成了新的物種，為研究物種的進(jìn)化提供了試驗(yàn)依據(jù)。龜谷和日向用蕓薹類植物胚珠培養(yǎng)得到了雜種植物，我國(guó)西北生物研究所進(jìn)行的小麥雌蕊離體授粉和煙草胚珠試管受精試驗(yàn)均獲得了成功。

5 單倍體育種

植物花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)可獲得純系材料進(jìn)行單倍體育種，克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性及雜種分離；對(duì)于異花授粉植物，可快速獲得自交系，提高育種效率。通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)發(fā)育成的單倍體植株，經(jīng)過(guò)染色體加倍獲得純合二倍體材料進(jìn)行植物遺傳規(guī)律研究，可減少育種的盲目性，在短期內(nèi)育成遺傳變異穩(wěn)定的具有優(yōu)良性狀的個(gè)體。自1964年Guha等獲得曼陀羅的花粉單倍體植株以來(lái)，通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)的單倍體育種技術(shù)，已經(jīng)作為一種嶄新的育種手段應(yīng)用于煙草、水稻、小麥、玉米、辣椒、草莓、蘋果以及許多藥用植物如枸杞、人參、平貝母中[6]。Raina等通過(guò)茄子花藥培養(yǎng)最早獲得茄子雙單倍體；1974年我國(guó)育成了世界上第一個(gè)單倍體作物新品種——單育1號(hào)煙草品種；Eber等通過(guò)培養(yǎng)甘藍(lán)型油菜單倍體植株的小孢子獲得非整倍體植株。

對(duì)于花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率過(guò)低和雄性不育的植物，在人工控制的條件下誘導(dǎo)大孢子或卵細(xì)胞增殖，形成單倍體植株。目前，單倍體植株的獲得主要是對(duì)花粉或花藥和未受精的子房和胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)[7-9]。試驗(yàn)證明，甜菜未授粉胚珠培養(yǎng)比花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率高，西葫蘆單核期的花藥和當(dāng)日開花未受精的子房愈傷組織誘導(dǎo)率最高，洋蔥開花前3～5 d的子房誘導(dǎo)頻率最高且有很高的遺傳穩(wěn)定性。朱至清設(shè)計(jì)N6花藥培養(yǎng)基，不僅在國(guó)內(nèi)得到推廣，而且在國(guó)外也被采用。此外，花粉植株的性狀變異率較胚珠培養(yǎng)獲得的單倍體植株高，在禾本科植物中，花粉植株試管苗玻璃化率較高，而子房和胚珠培養(yǎng)獲得的單倍體植株試管苗玻璃化率較低。

6 基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)

植物分子遺傳學(xué)的研究離不開組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)手段，轉(zhuǎn)基因技術(shù)克服了植物育種中的盲目性，快速有效地創(chuàng)造遺傳變異，是實(shí)現(xiàn)植物改良、增加產(chǎn)量和改善品質(zhì)的一項(xiàng)新技術(shù)。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，可獲得生根率達(dá)80%以上的甘藍(lán)型油菜抗性再生植株；N P TⅡ基因、抗蟲基因都已成功導(dǎo)入茄子。近年來(lái)，植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于大田作物、蔬菜、林木、花卉、禾本科牧草、藥用植物的抗性及單性結(jié)實(shí)等方面，目前已有100余種植物成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，如利用基因轉(zhuǎn)換得到茄子的單性果實(shí)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法提高紫花苜蓿中縮合單寧的含量，大白菜抗生素潮霉素和抑菌抗生素特美汀轉(zhuǎn)基因植株的獲得，組織培養(yǎng)體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系改良馬鈴薯品質(zhì)的建立，轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆、延熟番茄等的產(chǎn)業(yè)化。

愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為目的基因?qū)爰按紊x產(chǎn)物生物合成的研究奠定了基礎(chǔ)。1990年，我國(guó)自行研制的抗煙草花葉病毒煙草在遼寧進(jìn)行商品化種植，成為世界上第一例商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植株。雖然對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品存在一定的質(zhì)疑，但基因工程技術(shù)在面臨資源匱乏、糧食短缺等全球性問(wèn)題上突顯了巨大潛力，賦予傳統(tǒng)植物新的特性，提高植物的抗性、產(chǎn)量及品質(zhì)，有利于植物的大面積種植和保護(hù)，且產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。在發(fā)展基因工程過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性也應(yīng)受到重視，應(yīng)該建立一套科學(xué)的安全性評(píng)價(jià)體系和判斷標(biāo)準(zhǔn)，在保證安全性的前提下，保護(hù)和促進(jìn)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物研究和應(yīng)用領(lǐng)域健康、可持續(xù)發(fā)展。

7 小結(jié)

綜上所述，植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)近年來(lái)得到了廣泛的關(guān)注和發(fā)展。目前，已擴(kuò)展到植物生長(zhǎng)學(xué)、生理學(xué)、胚胎學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域。特別是近20年來(lái)，植物組織培養(yǎng)不僅在基礎(chǔ)的理論研究上具有重要價(jià)值，而且在實(shí)際應(yīng)用中越來(lái)越顯示出其優(yōu)越性，已成為從實(shí)驗(yàn)室研究到大規(guī)模工業(yè)化育苗的新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、園藝、林業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。此外，與傳統(tǒng)的優(yōu)良種質(zhì)材料的繁殖和保存、突變體的誘導(dǎo)和篩選等方法相比，該技術(shù)在時(shí)間和空間上具有更大的優(yōu)勢(shì)?？傊?，植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將深入到人們的生產(chǎn)、生活、科研等各個(gè)領(lǐng)域，并將得到不斷提高。