熱休克蛋白Gp96在肝癌、肝纖維化、乙型肝炎中作用的研究進(jìn)展

高 熙，李三強(qiáng)

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，河南 洛陽 471003)

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)Gp96是HSP90家族的重要一員，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在機(jī)體應(yīng)激情況下,發(fā)生過表達(dá),并作為分子伴侶調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和降解，參與多種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[1-2]。Gp96在不同肝臟疾病中存在著不同的作用機(jī)制。本文就Gp96在肝癌、肝纖維化、乙型肝炎等肝臟疾病中作用的國內(nèi)外相關(guān)研究綜述如下。

1 Gp96在肝癌中的作用

肝癌是發(fā)病率居我國第4位的惡性腫瘤，居腫瘤致死病因的第3位，嚴(yán)重威脅著人們的健康[3-4]。Gp96高表達(dá)于不同惡性腫瘤中，說明Gp96的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展之間存在聯(lián)系[5-7]。多項研究[8-9]表明，Gp96可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起作用。

1.1 Gp96在肝癌發(fā)生中的作用Rachidi等[8]采用白蛋白-環(huán)化重組酶小鼠與Gp96浮動小鼠雜交來系統(tǒng)研究Gp96在肝癌中的作用。結(jié)果表明，Gp96在機(jī)體內(nèi)有著維持肝臟穩(wěn)態(tài)的作用，在人肝癌中的遺傳和藥理抑制作用干擾了多種生長信號，并抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。Gp96的失活會促進(jìn)長鏈神經(jīng)酰胺的適應(yīng)性積累，并伴隨著殘余Gp96肝細(xì)胞的脂肪再生。Gp96背景中的Gp96陽性細(xì)胞需要代償性擴(kuò)增，使小鼠在Gp96陽性肝細(xì)胞中產(chǎn)生致癌物所致的肝細(xì)胞增生和腫瘤。Huang等[9]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Gp96反映了低應(yīng)答和低存活率。Gp96在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)高于正常肝細(xì)胞系。此外，Gp96的缺失對某些腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。在小鼠異種移植模型中，當(dāng)Gp96沉默時可能通過抑制蛋白激酶B(AKT)/內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶通路來顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，這提示了Gp96/AKT信號可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。盛春海等[10]在人肝癌Huh7細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了野生型和miR-642a結(jié)合位點(diǎn)突變的Gp96 3’UTR的螢光素酶報告基因質(zhì)粒，并通過PCR和Western-blot等方法檢測miR-642a和DOHH的mRNA及其蛋白水平。實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gp96 mRNA的3’UTR作為內(nèi)源競爭RNA可上調(diào)腫瘤基因DOHH的表達(dá)，促進(jìn)了肝癌的發(fā)生、發(fā)展。Chen等[11]采用白蛋白-環(huán)化重組酶系統(tǒng)建立了肝特異性Gp96基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)Gp96缺乏可導(dǎo)致肝祖細(xì)胞過度增殖并伴輕度肝損傷，其與細(xì)胞黏附受損有關(guān)。肝臟中Gp96的缺失可選擇性激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)，促進(jìn)肝癌的發(fā)展。Wang等[12]用戊二醛交聯(lián)法構(gòu)建了含有分子伴侶Gp96和甲胎蛋白(alpha-fetoprotoine,AFP)的蛋白疫苗來研究Gp96是否能提高AFP的免疫原性以及Gp96能否協(xié)同增強(qiáng)AFP治療效果。結(jié)果表明，AFP和Gp96協(xié)同作用能夠顯著增強(qiáng)AFP特異性CD8細(xì)胞反應(yīng)，對AFP表達(dá)的腫瘤有顯著抗腫瘤作用。吳信華等[13]在探討抑制Gp96對HepG2細(xì)胞中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響中發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞中Gp96及hTERT的表達(dá)較正常均升高，而加入HSP90抑制劑戈爾德霉素可使兩者表達(dá)顯著減少，同時HepG2細(xì)胞增殖也明顯受到抑制，因此可以說明Gp96在肝癌細(xì)胞中通過影響hTERT的活性，從而影響肝癌細(xì)胞端粒酶復(fù)制和細(xì)胞增殖，最終達(dá)到影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展的目的。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)從H22肝癌細(xì)胞中提純Gp96-肽復(fù)合物在體外對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(peritoneal exudative macrophage, PEMφ)的免疫功能具有直接激活作用：Gp96不僅可以增加PEMφ殺瘤效應(yīng)分子一氧化氮和活性氧的產(chǎn)生，增強(qiáng)非特異性抗腫瘤作用，還可以激活PEMφ，上調(diào)抗原遞呈分子的表達(dá)，增強(qiáng)抗原呈遞的能力，說明Gp96可以通過影響巨噬細(xì)胞的功能來對抗肝癌。Wang等[15]采用人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中的Gp96沖擊樹突狀細(xì)胞，激活自體T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Gp96沖擊的樹突狀細(xì)胞具有刺激自體T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)SMMC-7721特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的功能，即針對腫瘤特異性抗原，表現(xiàn)出主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類限制性細(xì)胞毒性；其還可以通過增強(qiáng)人類白細(xì)胞抗原Ⅱ類、CD80、CD86、CD83和CD40的表達(dá)而誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟。結(jié)果表明，Gp96可以誘導(dǎo)多種抗腫瘤免疫反應(yīng)，而不需要預(yù)先識別腫瘤相關(guān)抗原。

1.2 Gp96在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用Wei等[16]用一種特異的短發(fā)夾RNA下調(diào)了Gp96基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，通過傷口愈合遷移、跨孔遷移和侵襲性測定，確定了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲性，證實(shí)沉默Gp96可抑制肝癌細(xì)胞的愈合、遷移和侵襲，并提示Gp96基因敲除可能通過抑制c-Jun信號來抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Wu等[17]研究發(fā)現(xiàn)Gp96能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯，并顯著減少細(xì)胞凋亡。通過分析凋亡相關(guān)蛋白來鑒定p53為Gp96客戶端蛋白，并推測Gp96作為支架蛋白增強(qiáng)MDM2 E3連接酶活性，從而增加P53的泛素化和降解。P53是一種抑癌基因，其突變體能夠使細(xì)胞持續(xù)增殖、減少凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外，Gp96基因敲除對體內(nèi)肝癌細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。Hou等[18]發(fā)現(xiàn)血漿膜Gp96可以通過調(diào)節(jié)uPAR增強(qiáng)肝臟的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。他們對88例原發(fā)性肝癌患者的漿膜Gp96水平進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，漿膜Gp96高表達(dá)時，肝臟腫瘤中尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)的表達(dá)水平也相應(yīng)增加。用siRNA靶向漿膜Gp96或阻斷漿膜Gp96-uPAR相互作用的特異性單克隆抗體在體外會抑制細(xì)胞的生長、存活和侵襲，并抑制肝癌的體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移。漿膜Gp96通過增加uPAR的蛋白穩(wěn)定性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)肝癌的進(jìn)展，可能是抑制uPAR介導(dǎo)的肝癌生長和轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。

2 Gp96在肝纖維化中的作用

趙彩霞等[19]用四氯化碳促進(jìn)大鼠發(fā)生肝纖維化，觀察大鼠肝臟組織的病理學(xué)變化及肝纖維化進(jìn)展的程度，并同時測定Gp96的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝纖維化的嚴(yán)重程度與Gp96的表達(dá)水平呈正相關(guān)，說明Gp96可以促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

3 Gp96在乙型肝炎中的作用

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的重大公共衛(wèi)生問題。有3.5億多人長期慢性感染，慢性乙型肝炎患者有高度的危險性發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌[20]。Gp96可能在抗HBV中起著一定的作用。Wang等[21]研究了Gp96介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗病毒作用中的價值。他們通過乙肝表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)聯(lián)合免疫聯(lián)合Gp96誘導(dǎo)抗病毒T細(xì)胞和抗HBsAg、HBcAg抗體免疫。通過與未免疫對照組相比，他們發(fā)現(xiàn)Gp96處理組細(xì)胞對HBcAg的反應(yīng)明顯增強(qiáng)，CD8陽性T細(xì)胞浸潤明顯增加,并且Gp96可使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cells,Tregs )降低30%～40%。實(shí)驗結(jié)果說明, Gp96可能通過增強(qiáng)Balb/c和轉(zhuǎn)基因小鼠的體液和T細(xì)胞應(yīng)答，降低Tregs頻率，增強(qiáng)抗HBV的活性。Li等[22]采用從正常小鼠肝臟中分離到的Gp96及其在大腸桿菌中表達(dá)的N端片段用于Balb/c小鼠的免疫接種。通過給8組小鼠皮下分別注射磷酸鹽緩沖液、Gp96、N端片段、單純HBsAg、HBsAg Gp96、HBsAg N端片段、HBsAg不完全佐劑、HBsAg N端片段(95 ℃加熱30 min)的磷酸鹽緩沖液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清抗HBsAg抗體水平后發(fā)現(xiàn)，HBsAg與Gp96或其N端片段免疫小鼠血清抗HBsAg抗體的平均滴度明顯高于ELISA檢測的HBsAg。他們認(rèn)為Gp96或其N端片段可顯著改善HBsAg誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，但不能增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，提示Gp96或其N端片段可增強(qiáng)HBV感染體液免疫應(yīng)答。Lin等[23]通過體外共培養(yǎng)實(shí)驗得出，Gp96刺激可增強(qiáng)Tregs增殖和抑制作用，而Gp96誘導(dǎo)的叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子p3、白介素-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的上調(diào)依賴于Toll樣受體2和Toll樣受體4介導(dǎo)的核因子κB的激活。通過高劑量Gp96免疫激活Tregs，可防止刀豆蛋白A和抗CD137誘導(dǎo)的T細(xì)胞肝臟炎癥，并可對抗導(dǎo)致肝臟破壞的免疫亢進(jìn)。

4 結(jié)語

Gp96在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，與肝癌、肝纖維化、乙型肝炎等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中存在著不同的作用機(jī)制，從不同的方面影響著肝臟疾病的進(jìn)展。因此，對于Gp96的深入研究可以更有助于肝臟疾病的臨床診斷，并可以作為肝臟疾病預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)。然而由于實(shí)驗的局限性，對Gp96在肝臟多種疾病中的作用機(jī)制、作用特點(diǎn)還有待進(jìn)一步更加深入的研究。