外泌體：探究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展和診治的新視角

唐衛(wèi)中

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院廣西腫瘤防治研究所

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大最常見的惡性腫瘤，也是導致腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因，嚴重威脅人類生命健康。2018年全球CRC新發(fā)病例超過180萬例，死亡病例約86.2萬例［1］，預計到2030年，全球CRC新發(fā)病例將達220萬例，死亡病例高達110萬例［2］。結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，預后差，因此早期診斷和及時治療對提高CRC患者的生存率和改善其預后尤為關(guān)鍵，研究并尋找高敏感性、高特異性的診斷方法以及更有效的治療方法具有重要意義。腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而外泌體作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，近年來成為腫瘤研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點。本文就外泌體在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展以及診斷和治療等方面的研究進行綜述。

1 外泌體的生物學特性

1987年，JOHNSTONE等［3］首次在體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中發(fā)現(xiàn)一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，并將其命名為exosome（外泌體）。外泌體是一種由細胞通過胞吐方式分泌至微環(huán)境中的囊泡，直徑為40～100 nm，具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)。人體中幾乎所有類型的細胞在正常生理及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。外泌體廣泛存在于血漿、唾液、尿液、母乳、羊水、腦脊液等多種體液中［4］。外泌體中富含多種生物活性物質(zhì)，包括核酸（如 miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA）、蛋白（如融合蛋白、膜轉(zhuǎn)運蛋白、熱休克蛋白）、脂質(zhì)（如膽固醇、磷脂）等，其成分不同取決于源細胞的功能狀態(tài)［5］。外泌體的釋放過程有很多種機制，最主要的是多囊體（MVB）與細胞膜融合。釋放的外泌體可通過直接融合過程、受體-配體融合過程或受體介導的內(nèi)吞作用等方式被受體細胞吸收［6］。大部分進入靶細胞內(nèi)的外泌體將被溶酶體所降解以供細胞代謝所需，而小部分的外泌體得以釋放出內(nèi)容物，并以此介導細胞間的通訊。外泌體參與細胞間的物質(zhì)交換，亦是細胞間通訊起關(guān)鍵作用的重要介質(zhì)，廣泛參與了抗原遞呈、免疫應答、細胞遷移、細胞分化等機體多種生物學過程［7-9］。隨著對外泌體研究的深入，已證實外泌體通過在細胞間傳遞基因和蛋白等多種重要活性物質(zhì)而調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。

2 外泌體在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用

近年來研究表明外泌體在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。腫瘤外泌體可以通過在細胞間傳遞DNA、mRNA、miRNA和癌蛋白等活性物質(zhì)來改變正常細胞的表型和生物學行為，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［10］。ZHANG 等［11］采用 EDU 結(jié)合試驗，檢測外泌體源性miR-200b對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響，以陰性對照外泌體（Exo-NC）處理的HCT-116和SW480細胞系為參照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)外泌體源性miR-200b處理的HCT-116和SW480細胞系的增殖能力顯著增強，而將HCT-116細胞系中的miR-200b敲除后，該細胞系的增殖能力顯著下降，提示外泌體miR-200b具有調(diào)控結(jié)直腸癌細胞生長的潛在能力。細胞所處的宿主缺氧是CRC重要的微環(huán)境特點，在缺氧條件下，由CRC細胞分泌的外泌體Wnt4尤其豐富，而Wnt4激活的β-catenin信號是內(nèi)皮細胞增殖和遷移的重要信號通路。研究表明缺氧的CRC細胞源性外泌體通過在內(nèi)皮細胞中傳遞Wnt4 mRNA來激活β-catenin信號，增強內(nèi)皮細胞的增殖和遷移能力，從而促進腫瘤生長和血管生成［12］。PENG等［13］研究發(fā)現(xiàn)來自CRC小鼠細胞系CT26的外泌體顯著促進腫瘤生長，降低動物存活率。腫瘤相關(guān)的巨噬細胞表現(xiàn)出M2表型，能夠與腫瘤微環(huán)境的細胞因子和趨化因子相互作用。該研究還發(fā)現(xiàn)CRC外泌體能夠?qū)⒕奘杉毎麖腗1型轉(zhuǎn)化為M2型，從而促進腫瘤的生長。腫瘤來源外泌體因含有多種免疫抑制分子而在腫瘤免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用。CHEN等［14］發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌外泌體蛋白SERPINA1、SERPINF2和MMP9表達上調(diào)與腫瘤生長的免疫逃逸有關(guān)。腫瘤轉(zhuǎn)移包括多個步驟，首先腫瘤細胞通過上皮細胞間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（EMT）脫落，經(jīng)物理轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)移到遠端器官。然后，腫瘤來源的外泌體作為腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分，使腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視，安排轉(zhuǎn)移點以便脫離的癌細胞植入［15］。LAN等［9］研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞源性外泌體中的miR-21-5p和miR-155-5p表達水平顯著升高。miR-21-5p和miR-155-5p通過M2型巨噬細胞源性外泌體轉(zhuǎn)移到結(jié)直腸癌細胞中，與BRG1編碼序列結(jié)合并下調(diào)BRG1的表達，而BRG1在結(jié)直腸癌中表達下調(diào)被認為是促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，表明M2型巨噬細胞通過外泌體靶向下調(diào)BRG1的表達，誘導結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲。WANG等［16］研究發(fā)現(xiàn)，來自高度肝轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞系（HT-29）的外泌體可以顯著增加低度肝轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細胞系（Caco-2）轉(zhuǎn)移瘤的負荷。該研究還發(fā)現(xiàn)采用HT-29來源外泌體處理的小鼠CXCR4表達水平相對較高，表明外泌體可能通過招募表達CXCR4的間質(zhì)細胞，形成一個有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，從而促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。另外，體外研究發(fā)現(xiàn)使用HT-29源性外泌體處理后，Caco-2細胞的遷移能力顯著增強，進一步表明外泌體在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌源性肝轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。GAO等［17］通過細胞遷移和侵襲實驗檢測外泌體lncRNA 91H對CRC細胞和正常人腸上皮細胞（FHC）的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC細胞經(jīng)腫瘤外泌體lncRNA 91H處理后遷移能力和侵襲性均明顯增強。這些結(jié)果均提示外泌體lncRNA 91H可能與CRC細胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)。ZENG等［18］研究發(fā)現(xiàn)miR-25-3p可以通過外泌體將CRC細胞轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞。外泌體miR-25-3p通過靶向KLF2和KLF4調(diào)控內(nèi)皮細胞中VEGFR2、ZO-1、閉合蛋白和閉合蛋白5的表達，從而促進血管通透性和血管新生。因此，外泌體介導的miRNA、lncRNA等核酸分子和蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)的交換，對結(jié)直腸癌發(fā)生演進過程中細胞的生長、增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移以及免疫應答等發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

3 外泌體在結(jié)直腸癌中的臨床應用

3.1 外泌體作為結(jié)直腸癌診斷和預后標志物

CRC患者的預后與疾病分期有關(guān)，CRC早期患者5年生存率可達90%，而晚期患者5年生存率不到10%。由于目前缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)CRC患者確診時已為中晚期，預后效果欠佳。因此，尋找CRC高敏感性和高特異性的早期診斷、療效預測和預后評估生物標志物對早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和治療CRC，提高CRC患者生存率具有重要意義。外泌體攜帶大量的蛋白質(zhì)和核酸，尤其是miRNA、lncRNA等RNA分子含量豐富，因此目前越來越多的研究關(guān)注外泌體作為CRC分子標志物的應用價值。ZHANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在CRC血漿外泌體中miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-18a-5p、miR-18b-5p 表達顯著升高，提示這些miRNA可作為CRC潛在的非侵入性診斷標志物。此外，有研究［20］發(fā)現(xiàn)，校正年齡、性別、血管浸潤腫瘤分級、TNM分期（Ⅲ/Ⅳ期）和轉(zhuǎn)移情況等因素后，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-548c-5p水平的降低與CRC總體生存時間縮短獨立相關(guān)（HR=3.40，95%CI：1.02～11.27）。該研究結(jié)果提示外泌體miR-548c-5p不僅可用于CRC鑒別診斷，在預后評估中也有一定的臨床價值。HU等［21］研究將CRC患者6個血清外泌體lncRNA（LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV_108266、LNCV6_84003、LNCV6_98602）表達水平與健康對照組比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRC患者的這6個血清外泌體lncRNA表達水平明顯升高，有望作為CRC早期診斷生物標志物。SUN等［22］發(fā)現(xiàn)外泌體CPNE3水平在CRC患者尤其是TNM晚期或遠處轉(zhuǎn)移患者中顯著升高，聯(lián)合檢測外泌體CPNE3和CEA診斷CRC，敏感度、特異度分別為81.2%、84.8%，明顯優(yōu)于單獨檢測外泌體CPNE3（敏感度、特異度分別為67.4%、84.4%）或者CEA（敏感度、特異度分別為54.3%、93.7%）。此外，外泌體CPNE3表達水平較低的CRC患者的無病生存期（HR=2.9，95%CI：1.3～6.4）和總生存期（HR=3.4，95%CI：1.2～9.9）顯著長于外泌體 CPNE3 表達水平較高的CRC患者。該研究結(jié)果提示CRC外泌體CPNE3可用于CRC早期診斷和預后評估。3.2 外泌體與結(jié)直腸癌化療耐藥性

化療是結(jié)直腸癌目前重要的治療手段之一，然而長期使用化療藥物導致耐藥是結(jié)直腸癌化療療效降低甚至化療失敗的主要原因。研究［23］表明，外泌體在腫瘤微環(huán)境中可通過促進藥物外排、傳遞耐藥分子等方式來增強腫瘤細胞對藥物的耐受作用。REN等［24］研究發(fā)現(xiàn)，與正常成纖維細胞衍生外泌體處理相比，腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAFs）衍生外泌體處理顯著增強了CRC細胞腫瘤干細胞的成球能力，降低了奧沙利鉑誘導的細胞凋亡。當使用外泌體抑制劑GW4869對CAFs外泌體分泌進行阻斷時，細胞凋亡明顯增加，表明CAFs可能通過分泌外泌體增強結(jié)直腸癌干細胞特性耐藥性。另外，研究還發(fā)現(xiàn)在CAFs衍生外泌體中l(wèi)ncRNA H19富集，且CAFs可通過外泌體將lncRNA H19轉(zhuǎn)移到CRC細胞，同時腫瘤組織中l(wèi)ncRNA H19的表達水平經(jīng)CAFs來源的外泌體處理后顯著增加，上述結(jié)果提示CAFs來源的外泌體向CRC細胞轉(zhuǎn)移lncRNA H19從而促進結(jié)直腸癌干細胞特性和奧沙利鉑耐受。該研究對CRC發(fā)生機制及化療藥物耐受過程進行了闡述，為CRC的臨床治療提供了新的思路和靶標。HU等［25］研究發(fā)現(xiàn)成纖維細胞外泌體中的主要重編程調(diào)控因子是Wnts，外泌體Wnts可增加分化CRC細胞的Wnt信號通路活性和耐藥性，而抑制Wnt的釋放可減弱這種效應。該研究結(jié)果表明，成纖維細胞外泌體Wnts可誘導腫瘤細胞去分化進而促進CRC的化療耐藥，提示干擾外泌體Wnt信號可能有助于提高化療敏感性。YANG等［26］研究結(jié)果顯示，來自西妥昔單抗耐藥細胞的外泌體UCA1的表達顯著增加，并將西妥昔單抗耐藥性傳遞給受體敏感細胞。該研究表明UCA1可能在西妥昔單抗耐藥中發(fā)揮作用，外泌體UCA1在CRC細胞中傳送西妥昔單抗耐藥，導致受體細胞中產(chǎn)生更大的西妥昔單抗耐藥性，提示外泌體UCA1對預測CRC患者西妥昔單抗耐藥性具有潛在的臨床意義。研究外泌體對結(jié)直腸癌化療耐藥性的影響將有助于進一步闡明結(jié)直腸癌耐藥的分子機制，也為克服或逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌耐藥提供新思路，例如通過抑制外泌體釋放、改變外泌體成分等方式逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌耐藥性［27］。

4 總結(jié)和展望

自1965年Gold證實糖蛋白抗原在檢測人類結(jié)腸癌中的作用以來，許多結(jié)直腸癌相關(guān)的血清腫瘤生物標志物被廣泛研究。外泌體的發(fā)現(xiàn)和研究為CRC的精準診斷和治療開辟了新的領(lǐng)域和方向。相較傳統(tǒng)液體活檢所檢測的細胞游離核酸和循環(huán)腫瘤細胞，外泌體在體液中濃度較高，易于富集，所包含的母細胞信息能長期穩(wěn)定存在并保持一定的生物學活性，而且外泌體所含的RNA、蛋白質(zhì)等可反映疾病進展、治療反應及轉(zhuǎn)歸，因此外泌體在臨床診療中具有很好的應用前景。然而目前針對外泌體的研究仍存在一些不足，如從體液中分離提取外泌體的技術(shù)和方法仍有待改進。在準確尋找外泌體靶基因，了解外泌體作用機制、目標蛋白、信號通路等方面也仍存在巨大的挑戰(zhàn)。隨著蛋白質(zhì)組學、高通量測序、轉(zhuǎn)錄組學及生物信息學分析等技術(shù)的快速發(fā)展，人們對外泌體在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的機制及其臨床應用價值研究將不斷深入，為結(jié)直腸癌早期診斷與治療、療效預測與預后判斷等方面開辟新的視角。